酿酒酵母感受态细胞
产品规格（CAT#: YCL1040）
NMY51 Chemically-Library Competent Cell: 600μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 300μl/1.2ml 保存：4℃（12个月）
PEG/LiAC: 15ml/60ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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NMY51 文库化转感受态细胞 |
YCL1040S |
5×600ul |
Carrier DNA 300ul×1
PEG/LiAC 15ml×1 |
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| YCL1040M | 20×600ul |
Carrier DNA 1.2ml×1 PEG/LiAC 60ml×1 |
基因型
MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4
产品说明
DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N端，然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs识别，导致 LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51 Chemically-Library Competent Cell为构建酵母文库用化转感受态，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>0.5×106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取600 µl冰上融化的Y2HGold感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-15 µg(加入DNA的体积不超过50µl，DNA纯度越高越好)，预处理的Carrier DNA 60 µl，PEG/LiAc 1ml，吸打几次混匀，转移到事先准备好的10ml圆底离心管中，补加PEG/LiAc 2ml，混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 2 min弃上清，ddH2O 10ml重悬，离心2min弃上清，ddH2O 1-10ml重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
5. 为提高转化效率也可5000 rpm离心 2 min弃上清后加入3ml YPD Plus(唯地CAT#：YC6006)重悬，30℃，200rpm摇菌1.5h。离心2min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，加入质粒DNA的体积不超过50ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但由此计算的转化效率会下降。
3. NMY51酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。
4. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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NMY51 文库化转感受态细胞 |
YCL1040S |
5×600ul |
Carrier DNA 300ul×1
PEG/LiAC 15ml×1 |
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| YCL1040M | 20×600ul |
Carrier DNA 1.2ml×1 PEG/LiAC 60ml×1 |
基因型
MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4
产品说明
DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N端，然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs识别，导致 LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。NMY51 Chemically-Library Competent Cell为构建酵母文库用化转感受态，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>0.5×106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取600 µl冰上融化的Y2HGold感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-15 µg(加入DNA的体积不超过50µl，DNA纯度越高越好)，预处理的Carrier DNA 60 µl，PEG/LiAc 1ml，吸打几次混匀，转移到事先准备好的10ml圆底离心管中，补加PEG/LiAc 2ml，混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 2 min弃上清，ddH2O 10ml重悬，离心2min弃上清，ddH2O 1-10ml重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
5. 为提高转化效率也可5000 rpm离心 2 min弃上清后加入3ml YPD Plus(唯地CAT#：YC6006)重悬，30℃，200rpm摇菌1.5h。离心2min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，加入质粒DNA的体积不超过50ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但由此计算的转化效率会下降。
3. NMY51酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。
4. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
