酿酒酵母感受态细胞
产品规格（CAT#: YCL1110）
EBY100 Chemically-Library Competent Cell: 600μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 300μl/1.2ml 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 15ml/60ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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EBY100 文库化转感受态细胞 |
YCL1110S |
5×600ul |
Carrier DNA 300ul×1
PEG/LiAC 15ml×1 |
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| YCL1110M | 20×600ul |
Carrier DNA 1.2ml×1 PEG/LiAC 60ml×1 |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100 Chemically-Library Competent Cell为构建酵母文库用化转感受态，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取600 µl冰上融化的EBY100感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-15 µg(加入DNA的体积不超过50ul，DNA纯度越高越好)，预处理的Carrier DNA 60 µl，PEG/LiAc 1ml，吸打几次混匀，转移到事先准备好的10ml圆底离心管中，补加PEG/LiAc 2ml，混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 2 min弃上清，ddH2O 10ml重悬，离心2min弃上清，ddH2O 1-10ml重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
5. 为提高转化效率也可5000 rpm离心 2 min弃上清后加入3ml YPD Plus重悬，30℃，200rpm摇菌1.5h。离心2min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. EBY100菌株内源Trp1基因是功能缺失的，但其为点突变，功能回复突变的概率约百万分之一，一管感受态涂SD/-Trp平板，有长出假阳性菌落的概率(0-10个)，这种概率很低，一般不影响试验。
3. 在进行EBY100酵母菌的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖。
4. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，YNB-CAA Medium(with galactose)，也可以使用SGR-CAA Medium（同时添加了半乳糖和棉子糖，目标蛋白的诱导效果更好）。
5. 棉子糖在EBY100菌株诱导表达时的作用：葡萄糖是最好的酵母碳源，利用率高，生长速度快，在葡萄糖存在时酵母优先利用葡萄糖，但是葡萄糖与半乳糖拮抗，所以在加入半乳糖诱导目的蛋白表达时要去除培养基中的葡萄糖；虽然有一些文献报道半乳糖可以同时作为半乳糖启动子的诱导剂和碳源使用，但在实际使用过程中酵母对半乳糖的同化能力很弱，若培养基中只含有半乳糖，酵母几乎不能生长，或生长很慢，目标蛋白的表达量会下降；在EBY100诱导表达培养基中添加1-2%的棉子糖可以促进酵母生长，提高目标蛋白的表达量。
6. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
7. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃ 48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃ 48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃ 60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺/四缺平板平板29℃ 80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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EBY100 文库化转感受态细胞 |
YCL1110S |
5×600ul |
Carrier DNA 300ul×1
PEG/LiAC 15ml×1 |
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| YCL1110M | 20×600ul |
Carrier DNA 1.2ml×1 PEG/LiAC 60ml×1 |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100 Chemically-Library Competent Cell为构建酵母文库用化转感受态，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取600 µl冰上融化的EBY100感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-15 µg(加入DNA的体积不超过50ul，DNA纯度越高越好)，预处理的Carrier DNA 60 µl，PEG/LiAc 1ml，吸打几次混匀，转移到事先准备好的10ml圆底离心管中，补加PEG/LiAc 2ml，混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 2 min弃上清，ddH2O 10ml重悬，离心2min弃上清，ddH2O 1-10ml重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
5. 为提高转化效率也可5000 rpm离心 2 min弃上清后加入3ml YPD Plus重悬，30℃，200rpm摇菌1.5h。离心2min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. EBY100菌株内源Trp1基因是功能缺失的，但其为点突变，功能回复突变的概率约百万分之一，一管感受态涂SD/-Trp平板，有长出假阳性菌落的概率(0-10个)，这种概率很低，一般不影响试验。
3. 在进行EBY100酵母菌的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖。
4. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，YNB-CAA Medium(with galactose)，也可以使用SGR-CAA Medium（同时添加了半乳糖和棉子糖，目标蛋白的诱导效果更好）。
5. 棉子糖在EBY100菌株诱导表达时的作用：葡萄糖是最好的酵母碳源，利用率高，生长速度快，在葡萄糖存在时酵母优先利用葡萄糖，但是葡萄糖与半乳糖拮抗，所以在加入半乳糖诱导目的蛋白表达时要去除培养基中的葡萄糖；虽然有一些文献报道半乳糖可以同时作为半乳糖启动子的诱导剂和碳源使用，但在实际使用过程中酵母对半乳糖的同化能力很弱，若培养基中只含有半乳糖，酵母几乎不能生长，或生长很慢，目标蛋白的表达量会下降；在EBY100诱导表达培养基中添加1-2%的棉子糖可以促进酵母生长，提高目标蛋白的表达量。
6. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
7. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢。以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃ 48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃ 48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃ 60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺/四缺平板平板29℃ 80-90h培养可见直径1 mm克隆。
