产品名称	产品货号	产品规格	说明书下载
电转KM71 感受态细胞	PE1003S	10×80ul
	PE1003M	50×80ul

基因型

his4, aox1::ARG4, arg4

表型（Phenotype）

Mut^S, Arg⁺, His^–

产品说明

KM71菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。KM71是组氨酸缺陷型菌株，基因组中组氨酸脱氢酶（His4）基因位点产生突变，自身无法合成组氨酸；部分携带HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPIC3.5K/pPIC9K/pAO815等）可以表达HIS4基因，与KM71互补，通过组氨酸缺陷培养基来筛选整合成功的阳性转化子；其他无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等）也可通过Zeocin或盐酸博来霉素筛选阳性转化子。KM71毕赤酵母的表型为MutS, Arg+, His^–，His^–表示KM71是组氨酸缺陷型菌株，不能在组氨酸缺陷型培养基中生长；Arg⁺表示KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因同时破坏了AOX1基因，产生了Mut^S表型；MutS表示KM71的AOX1基因功能被破坏（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut⁺型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为Mut^S的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut⁺还是Mut^S作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut⁺型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；Mut^S型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut⁺少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质）。KM71电转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPIC9K质粒（9.3kb，Amp^R in E.coli）检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取适量1M山梨醇溶液（0.45um过滤除菌）冰浴，每管感受态准备1ml。

2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

3. 取-80℃保存的KM71电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入2-10ug线性化的目的DNA (加入DNA的体积不超过8ul，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)，立即插入冰中。

4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。

5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预冷的1M山梨醇溶液，转移到30℃静置2-3小时。

6. 将感受态-DNA混合物转移到离心管中，4000 rpm离心30秒收菌，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。

筛选培养基配制

1. KM71可用组氨酸缺陷培养基筛选阳性菌落，常用培养基为SD/–His固体培养基或MD培养基，配方如下:

2. 无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒转化KM71，可用YPDS+Zeocin/盐酸博莱霉素筛选，1L配方如下:

• 蛋白胨（peptone）                           20g

• 酵母提取物（yeast extract）              10g

• 山梨醇（sorbitol）                       182.2 g

补水到 950ml，用盐酸调PH到       7.0±0.2；

     • 琼脂粉（agar）                        20g(for plates only)

       121℃，20 min高压灭菌；待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的50% 葡萄糖40 ml。 

      • 加入100 mg/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素母液到培养基中，终浓度100 ug/ml，倒平板。

      • 含有Zeocin/盐酸博莱霉素的YPDS可以在4°C保存两周（半衰期约10-15天）。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。

2. 关于Zeocin/盐酸博莱霉素的使用浓度：Zeocin抗性基因单拷贝插入毕赤酵母基因组可用100 ug/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素浓度筛选；多拷贝整合可增加毕赤酵母对Zeocin/盐酸博莱霉素的抗性水平，每增加一个拷贝，Zeocin/盐酸博莱霉素的筛选浓度可增加200 ug/ml，所以为了筛选到高拷贝的蛋白表达框可增加抗生素的使用浓度到500, 1000, 甚至2000 μg/ml。

3. KM71酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。