根癌农杆菌感受态细胞
产品规格 （CAT#: AC1032）
LBA4404(pSoup)： 100μl/支
pGs2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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LBA4404(pSoup) 感受态细胞 |
AC1032S |
10×100ul |
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| AC1032M | 50×100ul | ||
| AC1032L | 100×100ul |
基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine(pSoup-tetR)
产品说明
LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。 pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性。在LBA4404菌株中转入help质粒：pSoup即为LBA4404(pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tetR）抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。本公司生产的LBA4404(pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2质粒（4445bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。LBA4404(pSoup)菌株液体摇菌时容易出现絮状悬浮物，离心后的菌块用枪吹散即可，不影响使用。
（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。
附言：
1. 农杆菌液体摇菌产生絮状沉淀的根源是胞外多糖（纤维素、UPP 单极多糖、curdlan 等）合成能力不同；胞外多糖会把菌体互相粘连，形成肉眼可见的絮状沉淀；多糖合成弱的菌株，没有絮状物；多糖合成强的菌株，细胞间容易发生黏连，易产生絮状沉淀。
2. 不同菌产生絮状沉淀的能力不同：发根农杆菌>根癌农杆菌>大肠杆菌。发根/根癌农杆菌不同菌株表型差异较大，K599、Lba4404更容易出现絮状菌体沉淀。
3. 农杆菌（根癌/发根）在自然生境中必须牢固附着在植物表皮/伤口细胞，才能启动 T-DNA 转移。所以农杆菌进化出附着植物细胞、表皮的细胞极性粘附多糖、纤维素微丝等结构，这些细胞结构导致农杆菌在液体摇菌时更容易黏连，聚集成絮状沉淀。
4. 影响农杆菌产生絮状沉淀的因素有：转速（转速越高越不易产生沉淀，一般设置200-220rpm）；菌液浓度（浓度越高，越容易产生沉淀，一般要求菌液OD600值不超过2.0；生长时期：对数期胞外多糖分泌量低，菌液最均匀，絮团最少，衰退期：更易产生沉淀。
● 农杆菌相关抗生素配方
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
75 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
|
庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素 (carb) |
链霉素 (strep) |
利福平 (rif) |
庆大霉素 (gent) |
硫酸卡那霉素 (kan) |
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AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
|
EHA101 |
S |
S |
R |
S |
R |
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EHA105 |
S |
S |
R |
S |
S |
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LBA4404 |
S |
R |
R |
S |
S |
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GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
● LB（唯地CAT#：CM1010）及YEB（唯地CAT#：CM2010）：
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Component |
LB(液体)/L |
LB(固体)/L |
component |
YEB(液体)/L |
YEB(固体)/L |
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Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
|
Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
|
NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
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Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
|
|
|
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
|
|
|
|
Agar |
－ |
15 g |
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，本公司生产的LBA4404(pSoup)化学转化感受态细胞具有四环素抗性，但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时，只需加入目标质粒抗性的抗生素，不加四环素。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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LBA4404(pSoup) 感受态细胞 |
AC1032S |
10×100ul |
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| AC1032M | 50×100ul | ||
| AC1032L | 100×100ul |
基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine(pSoup-tetR)
产品说明
LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。 pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性。在LBA4404菌株中转入help质粒：pSoup即为LBA4404(pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tetR）抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。本公司生产的LBA4404(pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2质粒（4445bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。LBA4404(pSoup)菌株液体摇菌时容易出现絮状悬浮物，离心后的菌块用枪吹散即可，不影响使用。
（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。
附言：
1. 农杆菌液体摇菌产生絮状沉淀的根源是胞外多糖（纤维素、UPP 单极多糖、curdlan 等）合成能力不同；胞外多糖会把菌体互相粘连，形成肉眼可见的絮状沉淀；多糖合成弱的菌株，没有絮状物；多糖合成强的菌株，细胞间容易发生黏连，易产生絮状沉淀。
2. 不同菌产生絮状沉淀的能力不同：发根农杆菌>根癌农杆菌>大肠杆菌。发根/根癌农杆菌不同菌株表型差异较大，K599、Lba4404更容易出现絮状菌体沉淀。
3. 农杆菌（根癌/发根）在自然生境中必须牢固附着在植物表皮/伤口细胞，才能启动 T-DNA 转移。所以农杆菌进化出附着植物细胞、表皮的细胞极性粘附多糖、纤维素微丝等结构，这些细胞结构导致农杆菌在液体摇菌时更容易黏连，聚集成絮状沉淀。
4. 影响农杆菌产生絮状沉淀的因素有：转速（转速越高越不易产生沉淀，一般设置200-220rpm）；菌液浓度（浓度越高，越容易产生沉淀，一般要求菌液OD600值不超过2.0；生长时期：对数期胞外多糖分泌量低，菌液最均匀，絮团最少，衰退期：更易产生沉淀。
● 农杆菌相关抗生素配方
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
75 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素 (carb) |
链霉素 (strep) |
利福平 (rif) |
庆大霉素 (gent) |
硫酸卡那霉素 (kan) |
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AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
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EHA101 |
S |
S |
R |
S |
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EHA105 |
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S |
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S |
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LBA4404 |
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R |
R |
S |
S |
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GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
● LB（唯地CAT#：CM1010）及YEB（唯地CAT#：CM2010）：
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Component |
LB(液体)/L |
LB(固体)/L |
component |
YEB(液体)/L |
YEB(固体)/L |
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Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
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Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
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NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
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NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
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Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
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NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
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Agar |
－ |
15 g |
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，本公司生产的LBA4404(pSoup)化学转化感受态细胞具有四环素抗性，但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时，只需加入目标质粒抗性的抗生素，不加四环素。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
引用唯地生物产品SCI文献统计信息
