溶液YB1使用前需先加入150ul RNaseA溶液，混匀，置2-8℃保存。

操作流程

1. 取 1–5 mL 酵母培养物（不超过5×107个酵母细胞）， 12000 rpm 离心 1 min，弃上清，吸干水份。

2. 加入 100 µL Lyticase buffer ，加入约20μL的Lyticase，充分混匀，并在摇床（转速200-220 rpm）30℃处理45~60 min。4000 rpm离心10 min，弃上清，收集沉淀。加入250 μL的YB1。

注意：以上Lyticase的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌菌株和酵母细胞数量不同，所用的Lyticase的用量和孵育时间应该进行适当调整。

3. 加入 250 µL YB2 裂解液轻轻颠倒混匀 6–8 次（不要振荡），室温放置 5-10 min，此时菌液应变得清亮粘稠。

4. 加入 350 µL YB3 中和液颠倒混匀6-8次，此时会出现白色絮状沉淀。12000 rpm 离心 10 min（如果上清中还有微小白色沉淀，可以再次离心后取上清）。

5. 上清转移至核酸纯化柱，12000 rpm离心 1 min 。

6. 步骤5的流出液重新倒到核酸纯化柱中，12000 rpm离心 1 min 。

7. 加入 500 µL RP去蛋白液，12000 rpm离心 1 min。

8. 加入 750 µL BW 漂洗液，12000 rpm离心 1 min。

9. 重复步骤8。

10. 再次离心（12000rpm，2 min）干燥柱膜，将纯化柱中的残余漂洗液去除。

11. 将纯化柱盖子打开，室温放置3分钟，以便纯化膜中的乙醇彻底挥发（此步骤可略过）。12. 将纯化柱放置于一个干净的离心管中，向纯化膜中间部位加入 50 µL洗脱液 EB，室温放置 2 min，12000 rpm离心2 min收集质粒（也可将洗脱液65℃预热，或将加入洗脱液的纯化柱和新离心管一起放入65℃金属浴5分钟，有助于提升洗脱效率）。

关于酵母质粒拷贝数及大肠扩繁质粒的说明

• 酵母质粒的常用复制子有两个：含2μ复制子的酵母质粒拷贝数为2-5个/Cell，含CEN/ARS复制子的酵母质粒拷贝数为1个/Cell；而大肠杆菌中质粒拷贝数通常为50-500个/Cell；酵母细胞的体积约100-150立方微米，大肠细胞的体积约1-1.5立方微米，这两个因素导致相同体积菌块提取的质粒，大肠是酵母的2500-25000倍。所以酵母提取的质粒无法通过电泳或分光光度计检测，也无法测序鉴定，无法酶切鉴定；可以作为PCR模板使用，也可以转化大肠杆菌扩繁质粒，通常建议使用量为：使用2-5μl用作PCR模板；使用5-10μl用于转化大肠杆菌。

• 转化大肠杆菌时应使用商业化的高效率感受态细胞（推荐唯地生物的DH5α Chemically Competent Cell，货号：DL1001；TOP10 Chemically Competent Cell，货号：DL1010）。

注意事项一

• 洗脱液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。

• 洗脱液pH值应在7.0-8.5之间，pH低于7.0会影响洗脱效率。

•  Lyticase 消化时间可根据菌株差异和菌体细胞量调整。

• 加入YB2后不要剧烈振荡，以避免基因组 DNA 断裂。

• 若产量偏低，可适当延长 Lyticase 作用时间。

注意事项二

1，点板之前，阴性对照，阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照，阳性对照，试验组的OD值一定要调一样。

2，稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。