酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1091）
∆smf1 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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∆smf1 感受态细胞 |
YC1091S |
10×100ul |
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| YC1091M | 50×100ul |
基因型
MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52 Δsmf1
产品说明
∆smf1菌株来源于酿酒酵母BY4741，为配子MATa型，主要应用于锰离子转运蛋白的研究中。SMF1(Suppressor of Mitochondria import Function)基因是二价金属离子转运蛋白，参与铜、铁、锰和镉离子的运输；∆smf1突变体中SMF1基因的整个编码区被删除，转运锰离子的能力降低，在SD/-Ura基础培养基（唯地货号：YM3104S）上可以正常生长，在含有高浓度二价阳离子螯合剂EGTA的SD/-Ura培养基上生长势变弱，是发现和研究锰离子或其他二价金属离子转运蛋白的高效试验平台。∆smf1酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2、pDR195、pDR196等质粒转化进入∆smf1细胞内，筛选标志为URA，可用SD-URA平板进行筛选。唯地生物生产的∆smf1感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1.Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的∆smf1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒1-3 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将感受态移到42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
锰离子转运试验示例/唯地生物验证试验
空载体pDR196为阴性对照； pDR196-smf1(表达酵母SMF1蛋白)为阳性对照；pDR196-OsNramp5(表达水稻OsNramp5蛋白)为试验组；这三个质粒分别转化 ∆smf1 酵母细胞，点板做表型分析。结果如图一所示： 在SD/-Ura基础培养基中酵母菌落正常生长，在SD/-Ura+50/60 mM EGTA 的培养基中，∆smf1(含pDR196-OsNramp5)菌株的生长势与阳性菌株∆smf1(含pDR196-smf1)一样，明显强于阴性菌株∆smf1 (含pDR196)，说明 OsNramp5基因具有转运锰离子的功能。
补充说明：
1. 酵母体内转运锰离子的基因有很多，所以阴性对照在含有高浓度的EGTA培养基中也可缓慢生长；
2. 螯合剂EGTA 的浓度需要实验者摸索，可配置不同 EGTA浓度(10 20 30 40 50 60mM)的梯度平板。
图一：酵母SMF1基因及水稻锰离子转运蛋白OsNramp5在∆smf1酵母突变体中的表型分析
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 酵母为真核生物，不易长期保存，建议保存时间不超过90天。
3. ∆smf1酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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∆smf1 感受态细胞 |
YC1091S |
10×100ul |
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| YC1091M | 50×100ul |
基因型
MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52 Δsmf1
产品说明
∆smf1菌株来源于酿酒酵母BY4741，为配子MATa型，主要应用于锰离子转运蛋白的研究中。SMF1(Suppressor of Mitochondria import Function)基因是二价金属离子转运蛋白，参与铜、铁、锰和镉离子的运输；∆smf1突变体中SMF1基因的整个编码区被删除，转运锰离子的能力降低，在SD/-Ura基础培养基（唯地货号：YM3104S）上可以正常生长，在含有高浓度二价阳离子螯合剂EGTA的SD/-Ura培养基上生长势变弱，是发现和研究锰离子或其他二价金属离子转运蛋白的高效试验平台。∆smf1酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2、pDR195、pDR196等质粒转化进入∆smf1细胞内，筛选标志为URA，可用SD-URA平板进行筛选。唯地生物生产的∆smf1感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1.Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的∆smf1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒1-3 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将感受态移到42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
锰离子转运试验示例/唯地生物验证试验
空载体pDR196为阴性对照； pDR196-smf1(表达酵母SMF1蛋白)为阳性对照；pDR196-OsNramp5(表达水稻OsNramp5蛋白)为试验组；这三个质粒分别转化 ∆smf1 酵母细胞，点板做表型分析。结果如图一所示： 在SD/-Ura基础培养基中酵母菌落正常生长，在SD/-Ura+50/60 mM EGTA 的培养基中，∆smf1(含pDR196-OsNramp5)菌株的生长势与阳性菌株∆smf1(含pDR196-smf1)一样，明显强于阴性菌株∆smf1 (含pDR196)，说明 OsNramp5基因具有转运锰离子的功能。
补充说明：
1. 酵母体内转运锰离子的基因有很多，所以阴性对照在含有高浓度的EGTA培养基中也可缓慢生长；
2. 螯合剂EGTA 的浓度需要实验者摸索，可配置不同 EGTA浓度(10 20 30 40 50 60mM)的梯度平板。
图一：酵母SMF1基因及水稻锰离子转运蛋白OsNramp5在∆smf1酵母突变体中的表型分析
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 酵母为真核生物，不易长期保存，建议保存时间不超过90天。
3. ∆smf1酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
