表达感受态细胞
产品规格 （CAT#: EC3010）
HMS174(DE3)： 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
HMS174(DE3) 感受态细胞 |
EC3010S |
10×100ul |
 |
| EC3010M | 50×100ul |
基因型
F-recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3)
产品说明
HMS174(DE3)菌株是K12菌株，与BL21系列菌株有较远的亲缘关系，有利于某些在B系列菌株中表达不成功蛋白的表达；此外具备两个显著特性：一是具有超高的转化效率，能实现高效转化；二是其拥有 K - 12 背景下的 recA 突变。该菌株可以使某些特定的靶基因保持稳定，这些靶基因表达的产物可能会致使 DE3 原噬菌体丢失，而 HMS174 菌株能抑制这种情况发生，保障相关基因的稳定性。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。HMS174(DE3)感受态细胞，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×109 cfu/µg DNA。
操作方法
1. HMS174(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化或处于冰水混合状态时加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基）。为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可）。
4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
HMS174(DE3) 感受态细胞 |
EC3010S |
10×100ul |
|
| EC3010M | 50×100ul |
基因型
F-recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3)
产品说明
HMS174(DE3)菌株是K12菌株，与BL21系列菌株有较远的亲缘关系，有利于某些在B系列菌株中表达不成功蛋白的表达；此外具备两个显著特性：一是具有超高的转化效率，能实现高效转化；二是其拥有 K - 12 背景下的 recA 突变。该菌株可以使某些特定的靶基因保持稳定，这些靶基因表达的产物可能会致使 DE3 原噬菌体丢失，而 HMS174 菌株能抑制这种情况发生，保障相关基因的稳定性。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。HMS174(DE3)感受态细胞，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×109 cfu/µg DNA。
操作方法
1. HMS174(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化或处于冰水混合状态时加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基）。为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，150 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 诱导时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可）。
4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
