酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1031）
EGY48(p8op-LacZ) Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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EGY48(p8op-LacZ) 感受态细胞 |
YC1031S |
10×100ul |
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| YC1031M | 50×100ul |
基因型
MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2 (p8op-LacZ：URA)
产品说明
EGY48菌株是Clontech公司开发的LexA系统酵母双杂实验用菌株，MATα型，将p8op-LacZ报告质粒转入EGY48即是EGY48(p8op-LacZ)，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；Transformation marker为：his3，trp1，EGY48的报告基因为LEU2；p8op-LacZ质粒的报告基因为LacZ；报告基因UAS (上游激活序列)来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LEU2、LacZ的表达。EGY48(p8op-LacZ)-LexA酵母双杂系统需要三种质粒配套使用：pLexA、pB42AD(即pJG4-5)、p8op-LacZ。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，用于表达DNA-BD(来自原核的202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，用于表达AD(来自疱疹病毒的88个氨基酸残基组成的B42AD蛋白)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白；报告质粒p8op-LacZ的筛选标志为URA3，报告基因为LacZ，报告基因UAS来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动报告基因表达。EGY48(p8op-LacZ)菌株中已经转入p8op-LacZ质粒，试验中只需要转入Bait和 Prey质粒即可完成酵母双杂试验，转化质粒成功率比EGY48更高。EGY48(p8op-LacZ)感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EGY48(p8op-LacZ)感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
6. EGY48(p8op-LacZ)菌株中已经含有p8op-LacZ质粒，如果试验共转入pLexA、pB42AD质粒，需涂SD/-His/-Trp/-Ura平板(唯地货号：YM3315S)；若单转pLexA质粒，涂SD/-His/-Ura平板(唯地货号：YM3214S)；若单转pB42AD质粒，涂SD/-Trp/-Ura平板(唯地货号：YM3234S)。
培养基配制
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① YPDA (1L)(唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。 |
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
3. EGY48(p8op-LacZ)菌株内源Trp1基因是功能缺失的，但其为点突变，功能回复突变的概率约百万分之一，一管感受态涂SD/-Trp平板，有长出假阳性菌落的概率(0-10个)，这种概率很低，一般不影响试验。
4. EGY48(p8op-LacZ)酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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EGY48(p8op-LacZ) 感受态细胞 |
YC1031S |
10×100ul |
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| YC1031M | 50×100ul |
基因型
MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2 (p8op-LacZ：URA)
产品说明
EGY48菌株是Clontech公司开发的LexA系统酵母双杂实验用菌株，MATα型，将p8op-LacZ报告质粒转入EGY48即是EGY48(p8op-LacZ)，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；Transformation marker为：his3，trp1，EGY48的报告基因为LEU2；p8op-LacZ质粒的报告基因为LacZ；报告基因UAS (上游激活序列)来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LEU2、LacZ的表达。EGY48(p8op-LacZ)-LexA酵母双杂系统需要三种质粒配套使用：pLexA、pB42AD(即pJG4-5)、p8op-LacZ。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，用于表达DNA-BD(来自原核的202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，用于表达AD(来自疱疹病毒的88个氨基酸残基组成的B42AD蛋白)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白；报告质粒p8op-LacZ的筛选标志为URA3，报告基因为LacZ，报告基因UAS来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动报告基因表达。EGY48(p8op-LacZ)菌株中已经转入p8op-LacZ质粒，试验中只需要转入Bait和 Prey质粒即可完成酵母双杂试验，转化质粒成功率比EGY48更高。EGY48(p8op-LacZ)感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EGY48(p8op-LacZ)感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
6. EGY48(p8op-LacZ)菌株中已经含有p8op-LacZ质粒，如果试验共转入pLexA、pB42AD质粒，需涂SD/-His/-Trp/-Ura平板(唯地货号：YM3315S)；若单转pLexA质粒，涂SD/-His/-Ura平板(唯地货号：YM3214S)；若单转pB42AD质粒，涂SD/-Trp/-Ura平板(唯地货号：YM3234S)。
培养基配制
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① YPDA (1L)(唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。 |
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
3. EGY48(p8op-LacZ)菌株内源Trp1基因是功能缺失的，但其为点突变，功能回复突变的概率约百万分之一，一管感受态涂SD/-Trp平板，有长出假阳性菌落的概率(0-10个)，这种概率很低，一般不影响试验。
4. EGY48(p8op-LacZ)酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
