酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1211）
THY.AP5 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
THY.AP5 感受态细胞 |
YC1211S |
10×100ul |
 |
| YC1211M | 50×100ul |
基因型
MATα;URA3,ade2-, his3-, leu2-, trp1-
产品说明
THY.AP5菌株是mbSUS assay酵母双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株THY.AP4通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ、HIS3、ADE2。mbSUS assay系统需要pNXgate、pXNgate和pMetYC gate质粒配套使用。质粒pNXgate/pXNgate的筛选标志为TRP1，用于表达Nub G与目标蛋白（Prey）的融合蛋白；质粒pMetYC gate的筛选标志为LEU，用于表达Cub-PLV与目标蛋白(Bait)的融合蛋白。mbSUS assay系统原理：自然状态的泛素的N端区域Nub和C端区域Cub能够自发组成完整的泛素蛋白，而Nub的突变形式NubG与Cub不互作，无法形成完整的泛素蛋白；将要检测的蛋白分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋白 (bait -CubPLV)和 prey融合蛋白 (prey-Nub)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub相互接近，形成完整的泛素蛋白，泛素蛋白能被USP识别，释放融合在Cub C端的人工转录因子PLV(protein A-LexA-VP16)，PLV能够进入细胞核中激活lacZ、HIS3、ADE2报告基因。唯地生物开发的THY.AP5感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检（7988bp，AmpR）测转化效率>104cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的THY.AP5感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
|
① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
|
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. THY.AP5酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
THY.AP5 感受态细胞 |
YC1211S |
10×100ul |
|
| YC1211M | 50×100ul |
基因型
MATα;URA3,ade2-, his3-, leu2-, trp1-
产品说明
THY.AP5菌株是mbSUS assay酵母双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株THY.AP4通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ、HIS3、ADE2。mbSUS assay系统需要pNXgate、pXNgate和pMetYC gate质粒配套使用。质粒pNXgate/pXNgate的筛选标志为TRP1，用于表达Nub G与目标蛋白（Prey）的融合蛋白；质粒pMetYC gate的筛选标志为LEU，用于表达Cub-PLV与目标蛋白(Bait)的融合蛋白。mbSUS assay系统原理：自然状态的泛素的N端区域Nub和C端区域Cub能够自发组成完整的泛素蛋白，而Nub的突变形式NubG与Cub不互作，无法形成完整的泛素蛋白；将要检测的蛋白分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋白 (bait -CubPLV)和 prey融合蛋白 (prey-Nub)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub相互接近，形成完整的泛素蛋白，泛素蛋白能被USP识别，释放融合在Cub C端的人工转录因子PLV(protein A-LexA-VP16)，PLV能够进入细胞核中激活lacZ、HIS3、ADE2报告基因。唯地生物开发的THY.AP5感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检（7988bp，AmpR）测转化效率>104cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的THY.AP5感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
|
① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
|
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. THY.AP5酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
