酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1180）
W303-1A Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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W303-1A 感受态细胞 |
YC1180S |
10×100ul |
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| YC1180M | 50×100ul |
基因型
MATa can1-100 ade2-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1
产品说明
W303 系列是由 Rodney Rothstein 实验室在20世纪80年代通过S288C和A364A的杂交构建而成的，目的是创建一套遗传背景清晰、携带多个常用选择标记、且适合进行遗传学操作（尤其是基因敲除和互补）的菌株系列。通过杂交和孢子分离，获得了具有不同交配型的同基因型单倍体菌株：W303-1A: MATa (a 交配型单倍体)和W303-1B: MATα (α 交配型单倍体)以及相应的二倍体 W303。W303-1A是一个遗传背景经典、携带多个重要突变（尤其是 ade2-1 和隐含的 rad5-535）的单倍体实验室酵母菌株，主要用于以下领域的研究：1. 遗传学操作和分析；2. 研究DNA 修复、复制压力响应和基因组稳定性的不可或缺的标准模型；W303-1A被发现对DNA 损伤剂（如 UV, MMS, 羟基脲 HU）异常敏感，这后来被追溯到其携带的一个隐性突变**rad5-535** (有时在基因型中不会明确列出，但存在于其 A364A 祖先血统中)，RAD5 是 DNA 损伤耐受途径（模板转换）的关键基因。这种内在的 DNA 修复缺陷使得W303成为研究DNA损伤应答、复制压力、修复途径和基因组不稳定性的极其重要和独特的模型；3. 进行细胞周期、染色体生物学等基础细胞过程研究的常用工具；由于其清晰的遗传背景和易于操作，W303 被广泛用于研究细胞周期调控、染色体分离、纺锤体组装检查点、端粒维持等基本细胞过程。W303-1A菌株的筛选标记为：leu2，ura3，trp1, his3，可配合诱导型质粒pYES2、pESC -LEU/URA/TRP/HIS或组成型表达质粒 pGADT7等使用。W303-1A感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的W303-1A感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
④ pYES2蛋白诱导用诱导培养基：SGR/-Ura (唯地CAT#：YEM3134): pESC-HIS/LEU/TRP/URA蛋白诱导分别用诱导培养基：SGR/-His、SGR/-Leu、SGR /-Trp、SGR/-Ura(唯地CAT#：YEM3131/3132/3133/3134)，1L配方如下: Yeast Nitrogen base 6.7g Dropout （对应的氨基酸混合物） 适量（按说明书） 补水到 800ml，调PH至5.8，121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：100 ml 20% 半乳糖，100 ml 10% 棉子糖。 |
② SD medium (1L) (唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。
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注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
2. W303-1A酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
3. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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W303-1A 感受态细胞 |
YC1180S |
10×100ul |
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| YC1180M | 50×100ul |
基因型
MATa can1-100 ade2-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1
产品说明
W303 系列是由 Rodney Rothstein 实验室在20世纪80年代通过S288C和A364A的杂交构建而成的，目的是创建一套遗传背景清晰、携带多个常用选择标记、且适合进行遗传学操作（尤其是基因敲除和互补）的菌株系列。通过杂交和孢子分离，获得了具有不同交配型的同基因型单倍体菌株：W303-1A: MATa (a 交配型单倍体)和W303-1B: MATα (α 交配型单倍体)以及相应的二倍体 W303。W303-1A是一个遗传背景经典、携带多个重要突变（尤其是 ade2-1 和隐含的 rad5-535）的单倍体实验室酵母菌株，主要用于以下领域的研究：1. 遗传学操作和分析；2. 研究DNA 修复、复制压力响应和基因组稳定性的不可或缺的标准模型；W303-1A被发现对DNA 损伤剂（如 UV, MMS, 羟基脲 HU）异常敏感，这后来被追溯到其携带的一个隐性突变**rad5-535** (有时在基因型中不会明确列出，但存在于其 A364A 祖先血统中)，RAD5 是 DNA 损伤耐受途径（模板转换）的关键基因。这种内在的 DNA 修复缺陷使得W303成为研究DNA损伤应答、复制压力、修复途径和基因组不稳定性的极其重要和独特的模型；3. 进行细胞周期、染色体生物学等基础细胞过程研究的常用工具；由于其清晰的遗传背景和易于操作，W303 被广泛用于研究细胞周期调控、染色体分离、纺锤体组装检查点、端粒维持等基本细胞过程。W303-1A菌株的筛选标记为：leu2，ura3，trp1, his3，可配合诱导型质粒pYES2、pESC -LEU/URA/TRP/HIS或组成型表达质粒 pGADT7等使用。W303-1A感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的W303-1A感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
④ pYES2蛋白诱导用诱导培养基：SGR/-Ura (唯地CAT#：YEM3134): pESC-HIS/LEU/TRP/URA蛋白诱导分别用诱导培养基：SGR/-His、SGR/-Leu、SGR /-Trp、SGR/-Ura(唯地CAT#：YEM3131/3132/3133/3134)，1L配方如下: Yeast Nitrogen base 6.7g Dropout （对应的氨基酸混合物） 适量（按说明书） 补水到 800ml，调PH至5.8，121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：100 ml 20% 半乳糖，100 ml 10% 棉子糖。 |
② SD medium (1L) (唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。
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注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
2. W303-1A酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
3. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
