克隆感受态细胞
产品规格（CAT#: DE3051）
MDS42 recA Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转MDS42 recA 感受态细胞 |
DE3051S |
5×50ul |
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| DE3051M | 20×50ul |
基因型
F- λ- lacZΔM15 ∆endA ∆fhuACDB ∆699gene
产品说明
MDS42 recA电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。MDS42 recA菌株来源于MG1655菌株，大肠杆菌基因组中含有大量非必需DNA(包括复合转座子、简单转座子（IS）、噬菌体/病毒序列/残留片段、假基因等)，这些非必需DNA的存在可导致基因组不稳定或提高大肠杆菌突变体产生的概率，在构建一些含有毒性基因片段、噬菌体片段或其他原核基因组片段的质粒时往往导致质粒结构的不稳定或质粒中部分片段的丢失，或错误重组。为了降低大肠杆菌基因组中这些无效DNA或有害DNA的影响，提高大肠杆菌基因组和质粒DNA的稳定性，利用合成生物学的方法，删除E.coli K-12系野生型MG1655菌株的非必需DNA，同时保留细菌生长和质粒复制，蛋白表达所需的必需基因，产生了MDS（Multiple-deletion Series）菌株。MDS42 recA为筛选出的第42号株系，此菌株共删除了704个基因（MG1655菌株基因组含有4,639,675个碱基，约4434个基因；MDS42 recA菌株基因组含有3,976,359个碱基，约3730个基因，缺失了663,316个碱基，占MG1655基因组的14.30%），其中fhuABCD四个基因的突变赋予MDS42 recA菌株对噬菌体T1的抗性；lacZΔM15使其可以用于蓝白斑筛选实验；核酸酶endA的删除有利于体内质粒DNA的稳定和高纯度DNA的提取；另外还有699个基因被成功删除。将recA1819突变引入，即是MDS42 recA，重组酶recA1819突变可降低错误重组的概率，提高质粒稳定性。MDS42 recA电转感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×1010 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量SOC放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml SOC）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的MDS42 recA电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的SOC（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
7. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中37度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2-3倍）
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
培养基配方：
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S.O.C 培养基（唯地CAT#：CM1014L）PH 7.0 |
TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）PH 7.2 |
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2% Tryptone 0.5% Yeast Extract 10 mM NaCl 2.5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 20 mM glucose S.O.C. is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency (Hanahan, 1983). |
1.2% Tryptone 2.4% Yeast Extract 0.4% 甘油 0.231% KH2PO4 1.254% K2HPO4 TB培养基中添加0.017M磷酸二氢钾和0.072M磷酸氢二钾成分，在大肠杆菌进入稳定后期可以稳定培养基ph值，提高菌体密度。 |
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转MDS42 recA 感受态细胞 |
DE3051S |
5×50ul |
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| DE3051M | 20×50ul |
基因型
F- λ- lacZΔM15 ∆endA ∆fhuACDB ∆699gene
产品说明
MDS42 recA电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。MDS42 recA菌株来源于MG1655菌株，大肠杆菌基因组中含有大量非必需DNA(包括复合转座子、简单转座子（IS）、噬菌体/病毒序列/残留片段、假基因等)，这些非必需DNA的存在可导致基因组不稳定或提高大肠杆菌突变体产生的概率，在构建一些含有毒性基因片段、噬菌体片段或其他原核基因组片段的质粒时往往导致质粒结构的不稳定或质粒中部分片段的丢失，或错误重组。为了降低大肠杆菌基因组中这些无效DNA或有害DNA的影响，提高大肠杆菌基因组和质粒DNA的稳定性，利用合成生物学的方法，删除E.coli K-12系野生型MG1655菌株的非必需DNA，同时保留细菌生长和质粒复制，蛋白表达所需的必需基因，产生了MDS（Multiple-deletion Series）菌株。MDS42 recA为筛选出的第42号株系，此菌株共删除了704个基因（MG1655菌株基因组含有4,639,675个碱基，约4434个基因；MDS42 recA菌株基因组含有3,976,359个碱基，约3730个基因，缺失了663,316个碱基，占MG1655基因组的14.30%），其中fhuABCD四个基因的突变赋予MDS42 recA菌株对噬菌体T1的抗性；lacZΔM15使其可以用于蓝白斑筛选实验；核酸酶endA的删除有利于体内质粒DNA的稳定和高纯度DNA的提取；另外还有699个基因被成功删除。将recA1819突变引入，即是MDS42 recA，重组酶recA1819突变可降低错误重组的概率，提高质粒稳定性。MDS42 recA电转感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×1010 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量SOC放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml SOC）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的MDS42 recA电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的SOC（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
7. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中37度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2-3倍）
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
培养基配方：
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S.O.C 培养基（唯地CAT#：CM1014L）PH 7.0 |
TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）PH 7.2 |
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2% Tryptone 0.5% Yeast Extract 10 mM NaCl 2.5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 20 mM glucose S.O.C. is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency (Hanahan, 1983). |
1.2% Tryptone 2.4% Yeast Extract 0.4% 甘油 0.231% KH2PO4 1.254% K2HPO4 TB培养基中添加0.017M磷酸二氢钾和0.072M磷酸氢二钾成分，在大肠杆菌进入稳定后期可以稳定培养基ph值，提高菌体密度。 |
