酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1170）
YTK12 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
YTK12 感受态细胞 |
YC1170S |
10×100ul |
 |
| YC1170M | 50×100ul |
基因型
MATa, trp1-1,ade2-101, his3, ura3-1, suc2
产品说明
YTK12菌株是一个蔗糖转化酶(SUC2)缺陷型酿酒酵母。酵母蔗糖转化酶(SUC2)可将蔗糖或棉子糖水解成葡萄糖和果糖；参与碳水化合物分解代谢；可以两种不同的形式定位于细胞质并分泌到细胞外起作用，该基因的N端有一个外分泌信号肽，这个信号肽引导蔗糖转化酶分泌到细胞外起作用。YTK12菌株中的SUC2基因被突变，无法合成蔗糖转化酶，通过酵母质粒：pSUC2 载体引入一个有功能的蔗糖转化酶基因，但是pSUC2 空载体的N端信号肽被切除，无法分泌到胞外，把不同的待验证的多肽连接到SUC2蛋白的N端就可以验证连入的多肽是否有分泌功能。YTK12 酵母菌株为 SUC2基因缺陷型菌种，无法在以棉子糖为单一碳源的YPRAA 培养基上正常生长。只有将具有分泌活性的信号肽序列连接在 pSUC2 载体蔗糖酶基因SUC2的 N 端，转化入 YTK12 酵母菌株中，才能使蔗糖转化酶正常分泌，YTK12 酵母才能将棉子糖转化为葡萄糖，在 YPRAA 培养基上正常生长(Jacobs et al 1997，Oh et al 2009)。另外，蔗糖转化酶(SUC2)的水解产物葡萄糖可以将 2,3,5-三苯基四唑氯(TTC)还原为不溶的红色物质1,3,5-三苯基甲酸(TPF)，通过显色反应也可以判断待验证多肽是否有分泌功能。YTK12菌株筛选标记(Transformation marker)为：trp1，his3，ura3；YTK12感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的YTK12感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬涂板，29℃培养48-96 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. YTK12酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
YTK12 感受态细胞 |
YC1170S |
10×100ul |
|
| YC1170M | 50×100ul |
基因型
MATa, trp1-1,ade2-101, his3, ura3-1, suc2
产品说明
YTK12菌株是一个蔗糖转化酶(SUC2)缺陷型酿酒酵母。酵母蔗糖转化酶(SUC2)可将蔗糖或棉子糖水解成葡萄糖和果糖；参与碳水化合物分解代谢；可以两种不同的形式定位于细胞质并分泌到细胞外起作用，该基因的N端有一个外分泌信号肽，这个信号肽引导蔗糖转化酶分泌到细胞外起作用。YTK12菌株中的SUC2基因被突变，无法合成蔗糖转化酶，通过酵母质粒：pSUC2 载体引入一个有功能的蔗糖转化酶基因，但是pSUC2 空载体的N端信号肽被切除，无法分泌到胞外，把不同的待验证的多肽连接到SUC2蛋白的N端就可以验证连入的多肽是否有分泌功能。YTK12 酵母菌株为 SUC2基因缺陷型菌种，无法在以棉子糖为单一碳源的YPRAA 培养基上正常生长。只有将具有分泌活性的信号肽序列连接在 pSUC2 载体蔗糖酶基因SUC2的 N 端，转化入 YTK12 酵母菌株中，才能使蔗糖转化酶正常分泌，YTK12 酵母才能将棉子糖转化为葡萄糖，在 YPRAA 培养基上正常生长(Jacobs et al 1997，Oh et al 2009)。另外，蔗糖转化酶(SUC2)的水解产物葡萄糖可以将 2,3,5-三苯基四唑氯(TTC)还原为不溶的红色物质1,3,5-三苯基甲酸(TPF)，通过显色反应也可以判断待验证多肽是否有分泌功能。YTK12菌株筛选标记(Transformation marker)为：trp1，his3，ura3；YTK12感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的YTK12感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬涂板，29℃培养48-96 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. YTK12酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
