酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1140）
EBY.VW4000 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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EBY.VW4000 感受态细胞 |
YC1140S |
10×100ul |
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| YC1140M | 50×100ul |
基因型
CEN.PK2-1C, MATa, hxt13Δ::loxP, hxt15ΔloxP, hxt16Δ::loxP, hxt14Δ::loxP, hxt12Δ::loxP, hxt9Δ::loxP, hxt11Δ::loxP, hx10Δ::loxP, hxt8Δ::loxP, hxt4-1-5Δ::loxP, hxt2Δ::loxP, hxt3-6-7Δ::loxP, gal2Δ::(ura3/FOA), stl1Δ::loxP, agt1Δ::loxP, mph2(ydl247w)Δ::loxP, mph3( yjr160c)Δ::loxP
产品说明
EBY.VW4000菌株来源于CEN.PK2-1C酵母菌株，MATa型，Transformation marker为ura3，可用于筛选标记为URA3的质粒的转化，比如pYES2/NT、pYC2/NT、pDR196、p416GDP、pESC-URA等质粒。酿酒酵母含有大量严格控制的具有不同特征的己糖转运蛋白，这些己糖转运蛋白有转运葡萄糖的潜力，大部分酵母中含有17个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1 - HXT17，CEN.PK2-1C只含有16个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1 - HXT16；GAL2：半乳糖渗透酶基因，为半乳糖利用所必须，同时具有运输葡萄糖的功能；还有三个麦芽糖转运蛋白家族成员（Agt1、Ydl247、Yjr160）能够运输己糖；此外，STL1（Sugar Transporter-Like protein）为质膜甘油质子同向转运体，也被认为参与到葡萄糖的转运代谢过程中。为了消除CEN.PK2-1C酵母对葡萄糖的摄取能力，利用Cre/LoxP系统将HXT1 - HXT16、GAL2、AGT1、YDL247w和YJR160c这些能够运输己糖的基因，加上STL1共21个基因全部删除，即是EBY.VW4000。EBY.VW4000作为己糖转运蛋白缺陷酵母菌株，其葡萄糖的吸收和转运活性被完全消除，其他己糖的吸收和转运能力也被消除，是发现和研究天然或异源（其他物种）己糖转运蛋白的高效试验平台。EBY.VW4000不能同化葡萄糖或其他己糖作为碳源，在含有2%麦芽糖的培养基中生长正常，培养WT细胞推荐使用YPM培养基；筛选含有质粒的酵母细胞推荐使用SM培养基。EBY.VW4000感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EBY.VW4000感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬涂板，29℃培养48-96 h（若用筛选标记为URA3的质粒，涂SM/-URA平板，唯地CAT#：YM5104S）。
培养基配制
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① YPM (1L) (唯地CAT#：YM1040): Tryptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 麦芽糖 50 ml。
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② SM/-URA with Agar (1L)(唯地CAT#：YM5104): Yeast Nitrogen base 6.7g DO Supplement -Ura 0.78g 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 麦芽糖 50 ml。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. EBY.VW4000酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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EBY.VW4000 感受态细胞 |
YC1140S |
10×100ul |
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| YC1140M | 50×100ul |
基因型
CEN.PK2-1C, MATa, hxt13Δ::loxP, hxt15ΔloxP, hxt16Δ::loxP, hxt14Δ::loxP, hxt12Δ::loxP, hxt9Δ::loxP, hxt11Δ::loxP, hx10Δ::loxP, hxt8Δ::loxP, hxt4-1-5Δ::loxP, hxt2Δ::loxP, hxt3-6-7Δ::loxP, gal2Δ::(ura3/FOA), stl1Δ::loxP, agt1Δ::loxP, mph2(ydl247w)Δ::loxP, mph3( yjr160c)Δ::loxP
产品说明
EBY.VW4000菌株来源于CEN.PK2-1C酵母菌株，MATa型，Transformation marker为ura3，可用于筛选标记为URA3的质粒的转化，比如pYES2/NT、pYC2/NT、pDR196、p416GDP、pESC-URA等质粒。酿酒酵母含有大量严格控制的具有不同特征的己糖转运蛋白，这些己糖转运蛋白有转运葡萄糖的潜力，大部分酵母中含有17个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1 - HXT17，CEN.PK2-1C只含有16个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1 - HXT16；GAL2：半乳糖渗透酶基因，为半乳糖利用所必须，同时具有运输葡萄糖的功能；还有三个麦芽糖转运蛋白家族成员（Agt1、Ydl247、Yjr160）能够运输己糖；此外，STL1（Sugar Transporter-Like protein）为质膜甘油质子同向转运体，也被认为参与到葡萄糖的转运代谢过程中。为了消除CEN.PK2-1C酵母对葡萄糖的摄取能力，利用Cre/LoxP系统将HXT1 - HXT16、GAL2、AGT1、YDL247w和YJR160c这些能够运输己糖的基因，加上STL1共21个基因全部删除，即是EBY.VW4000。EBY.VW4000作为己糖转运蛋白缺陷酵母菌株，其葡萄糖的吸收和转运活性被完全消除，其他己糖的吸收和转运能力也被消除，是发现和研究天然或异源（其他物种）己糖转运蛋白的高效试验平台。EBY.VW4000不能同化葡萄糖或其他己糖作为碳源，在含有2%麦芽糖的培养基中生长正常，培养WT细胞推荐使用YPM培养基；筛选含有质粒的酵母细胞推荐使用SM培养基。EBY.VW4000感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EBY.VW4000感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬涂板，29℃培养48-96 h（若用筛选标记为URA3的质粒，涂SM/-URA平板，唯地CAT#：YM5104S）。
培养基配制
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① YPM (1L) (唯地CAT#：YM1040): Tryptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 麦芽糖 50 ml。
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② SM/-URA with Agar (1L)(唯地CAT#：YM5104): Yeast Nitrogen base 6.7g DO Supplement -Ura 0.78g 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 麦芽糖 50 ml。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. EBY.VW4000酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
