酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1120）
WAT11 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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WAT11 感受态细胞 |
YC1120S |
10×100ul |
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| YC1120M | 50×100ul |
基因型
MATα, ade2-1, his3-11,-15, can1-100, leu2-3,-112, ura3-1, trp1-1, GAL10-CYC1:: ATR1
产品说明
WAT11菌株来源于W303-1B 酵母菌株，将酵母菌内源的细胞色素P450还原酶替换成拟南芥的细胞色素P450还原酶（Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P-450 reductase / ATR1）即是WAT11，此菌株可诱导表达拟南芥P450还原酶，具有更高的P450还原酶活性和更加完善的电子传递系统，广泛用于各种代谢途径的研究或P450参与的通路研究。筛选标记(Transformation marker)为：trp1，leu2，his3，ura3，可配合诱导型质粒pYES2、pESC-HIS/LEU/TRP/URA或组成型表达质粒pGBKT7/ pGADT7等使用。WAT11感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的WAT11感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
● P450还原酶的诱导表达
1. WAT11菌株中的P450还原酶由GAL10-CYC1启动子驱动，在进行诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖或同时分别加入2%的半乳糖和1%棉子糖。两种碳源配方都可以诱导P450还原酶的表达，但在只添加半乳糖的培养基中酵母生长缓慢，蛋白表达量低；同时添加棉子糖可提高P450还原酶的表达量。
2. 半乳糖的诱导时间以至少12小时为宜，不同的实验要求，实验者可根据需要确定诱导时间。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
④ pYES2蛋白诱导用诱导培养基：SGR/-Ura (唯地CAT#：YEM3134): pESC-HIS/LEU/TRP/URA蛋白诱导分别用诱导培养基：SGR/-His、SGR/-Leu、SGR /-Trp、SGR/-Ura(唯地CAT#：YEM3131/3132/3133/3134)，1L配方如下: Yeast Nitrogen base 6.7g Dropout （对应的氨基酸混合物） 适量（按说明书） 补水到 800ml，调PH至5.8，121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：100 ml 20% 半乳糖，100 ml 10% 棉子糖。 |
② SD medium (1L) (唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。
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注意事项
2. WAT11酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
3. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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WAT11 感受态细胞 |
YC1120S |
10×100ul |
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| YC1120M | 50×100ul |
基因型
MATα, ade2-1, his3-11,-15, can1-100, leu2-3,-112, ura3-1, trp1-1, GAL10-CYC1:: ATR1
产品说明
WAT11菌株来源于W303-1B 酵母菌株，将酵母菌内源的细胞色素P450还原酶替换成拟南芥的细胞色素P450还原酶（Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P-450 reductase / ATR1）即是WAT11，此菌株可诱导表达拟南芥P450还原酶，具有更高的P450还原酶活性和更加完善的电子传递系统，广泛用于各种代谢途径的研究或P450参与的通路研究。筛选标记(Transformation marker)为：trp1，leu2，his3，ura3，可配合诱导型质粒pYES2、pESC-HIS/LEU/TRP/URA或组成型表达质粒pGBKT7/ pGADT7等使用。WAT11感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的WAT11感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
● P450还原酶的诱导表达
1. WAT11菌株中的P450还原酶由GAL10-CYC1启动子驱动，在进行诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖或同时分别加入2%的半乳糖和1%棉子糖。两种碳源配方都可以诱导P450还原酶的表达，但在只添加半乳糖的培养基中酵母生长缓慢，蛋白表达量低；同时添加棉子糖可提高P450还原酶的表达量。
2. 半乳糖的诱导时间以至少12小时为宜，不同的实验要求，实验者可根据需要确定诱导时间。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (1L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 2g； 补水到1L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
④ pYES2蛋白诱导用诱导培养基：SGR/-Ura (唯地CAT#：YEM3134): pESC-HIS/LEU/TRP/URA蛋白诱导分别用诱导培养基：SGR/-His、SGR/-Leu、SGR /-Trp、SGR/-Ura(唯地CAT#：YEM3131/3132/3133/3134)，1L配方如下: Yeast Nitrogen base 6.7g Dropout （对应的氨基酸混合物） 适量（按说明书） 补水到 800ml，调PH至5.8，121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的carbon source：100 ml 20% 半乳糖，100 ml 10% 棉子糖。 |
② SD medium (1L) (唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。
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注意事项
2. WAT11酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
3. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
