表达感受态细胞
产品规格 （CAT#: EC2200）
ClearColi BL21(DE3) Competent Cell： 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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ClearColi BL21(DE3) 感受态细胞 |
EC2200S |
10×100ul |
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| EC2200M | 50×100ul |
基因型
F- ompT hsdSB(rB-mB- ) gal dcm lon λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP ΔeptA
产品说明
ClearColi BL21(DE3)来源于BL21(DE3)，在BL21(DE3)中引入8个独立基因突变，导致ClearColi BL21(DE3)细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，破坏了ClearColi BL21(DE3)大肠杆菌的内毒素信号通路；正常的LPS含有六个酰基链，含有六个酰基链的LPS可以被受体TLR4识别，激活内毒素反应，而只含有四个酰基链的LPS不能被TLR4识别，因此不触发内毒素反应。 从ClearColi BL21(DE3)细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素蛋白或多肽广泛应用于哺乳动物试验，疾病治疗等。ClearColi BL21(DE3)同时为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解，提高了目标蛋白的稳定性和表达量。 λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于ClearColi BL21(DE3)的染色体上，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。ClearColi BL21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>107 cfu/μg DNA。
操作方法
注意：ClearColi BL21(DE3)的细胞壁被破坏，对渗透势敏感，培养基中一般要求含有1%的氯化钠，可用高盐浓度的LB Miller配方(Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g)，不可用SOB、2YT等低盐培养基。
1. ClearColi BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的LB，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养36小时(ClearColi BL21(DE3)菌株生长缓慢，需延长培养时间)。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（唯地CAT#：CM1010L）培养基，接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约15-24h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB培养基中，为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，200 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要3-4h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，200 rpm摇菌3-6h。
（不同蛋白诱导的最佳温度/时间有差异，需实验者做梯度试验确定，常用的温度/时间组合有：37℃/3-6h、20℃/12-24h、16℃/12-30h、12℃/12-48h）。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h—取样，离心后放-20℃保存）。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. ClearColi BL21(DE3)的细胞壁被破坏，对渗透势敏感，培养基中一般要求含有1%的氯化钠，可用高盐浓度的LB Miller配方(Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g)，不可用SOB、2YT等低盐培养基。
3. 培养基中最好不含有Mg2+和Ca2+，这两种离子会抑制ClearColi BL21(DE3)生长
4. ClearColi BL21(DE3)菌株生长缓慢，生长速度约为普通BL21(DE3)的1/2，固体培养或液体摇菌时均需适当延长培养时间，为了获得最佳的诱导蛋白可同时增加液体培养基的溶氧。
5. ClearColi BL21(DE3)容易聚集，特别是在菌体生长后期容易聚集成团，测OD值时需用枪吹打使其分散。
6. 诱导时，IPTG浓度可选择浓度，0.1-2 mM均可，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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ClearColi BL21(DE3) 感受态细胞 |
EC2200S |
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| EC2200M | 50×100ul |
基因型
F- ompT hsdSB(rB-mB- ) gal dcm lon λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxL ΔlpxM ΔpagP ΔlpxP ΔeptA
产品说明
ClearColi BL21(DE3)来源于BL21(DE3)，在BL21(DE3)中引入8个独立基因突变，导致ClearColi BL21(DE3)细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，破坏了ClearColi BL21(DE3)大肠杆菌的内毒素信号通路；正常的LPS含有六个酰基链，含有六个酰基链的LPS可以被受体TLR4识别，激活内毒素反应，而只含有四个酰基链的LPS不能被TLR4识别，因此不触发内毒素反应。 从ClearColi BL21(DE3)细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素蛋白或多肽广泛应用于哺乳动物试验，疾病治疗等。ClearColi BL21(DE3)同时为Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，这两种酶的缺失有效防止异源蛋白在大肠杆菌体内的降解，提高了目标蛋白的稳定性和表达量。 λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于ClearColi BL21(DE3)的染色体上，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。ClearColi BL21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>107 cfu/μg DNA。
操作方法
注意：ClearColi BL21(DE3)的细胞壁被破坏，对渗透势敏感，培养基中一般要求含有1%的氯化钠，可用高盐浓度的LB Miller配方(Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g)，不可用SOB、2YT等低盐培养基。
1. ClearColi BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的LB，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养36小时(ClearColi BL21(DE3)菌株生长缓慢，需延长培养时间)。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（唯地CAT#：CM1010L）培养基，接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约15-24h。
3. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB培养基中，为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
4. 37℃，200 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要3-4h）。
5. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
6. 第四步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为1mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，200 rpm摇菌3-6h。
（不同蛋白诱导的最佳温度/时间有差异，需实验者做梯度试验确定，常用的温度/时间组合有：37℃/3-6h、20℃/12-24h、16℃/12-30h、12℃/12-48h）。
7. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h—取样，离心后放-20℃保存）。
8. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
9. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. ClearColi BL21(DE3)的细胞壁被破坏，对渗透势敏感，培养基中一般要求含有1%的氯化钠，可用高盐浓度的LB Miller配方(Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g)，不可用SOB、2YT等低盐培养基。
3. 培养基中最好不含有Mg2+和Ca2+，这两种离子会抑制ClearColi BL21(DE3)生长
4. ClearColi BL21(DE3)菌株生长缓慢，生长速度约为普通BL21(DE3)的1/2，固体培养或液体摇菌时均需适当延长培养时间，为了获得最佳的诱导蛋白可同时增加液体培养基的溶氧。
5. ClearColi BL21(DE3)容易聚集，特别是在菌体生长后期容易聚集成团，测OD值时需用枪吹打使其分散。
6. 诱导时，IPTG浓度可选择浓度，0.1-2 mM均可，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
