酿酒酵母感受态细胞
产品规格（CAT#: YEL1110）
EBY100 Elec-Library Cell: 400μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
YB溶液（0.45um过滤除菌）: 50ml/200ml 保存： 4℃（3个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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EBY100 文库电转感受态细胞 |
YEL1110S |
5×400ul |
YB溶液 50ml×1 |
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| YEL1110M | 20×400ul | YB溶液 50ml×4 |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100 Elec-Library Competent Cell为构建酵母文库用电转感受态细胞，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量YB溶液（0.45um过滤除菌）放30度预热，每管感受态准备10ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的EBY100电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入预冷的目的质粒2-15ug (加入DNA的体积不超过40ul，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.5kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预热的YB溶液，转移到无菌的50ml离心管中，再加入1ml YB溶液清洗电转杯并转移到离心管中，补加8ml YB溶液，30℃ 250rpm 摇菌1.5h。
6. 3000 rpm离心 2 min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化, 加入质粒DNA的体积不超过40ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但是由此计算的转化效率会下降。
3. 在进行EBY100的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖或同时加入2%的半乳糖和棉子糖。
4. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，YNB-CAA Medium(with galactose)，也可以使用SGR-CAA Medium（同时添加了半乳糖和棉子糖，目标蛋白的诱导效果更好）。
5. 棉子糖在EBY100菌株诱导表达时的作用：葡萄糖是最好的酵母碳源，利用率高，生长速度快，在葡萄糖存在时酵母优先利用葡萄糖，但是葡萄糖与半乳糖拮抗，所以在加入半乳糖诱导目的蛋白表达时要去除培养基中的葡萄糖；虽然有一些文献报道半乳糖可以同时作为半乳糖启动子的诱导剂和碳源使用，但在实际使用过程中酵母对半乳糖的同化能力很弱，若培养基中只含有半乳糖，酵母几乎不能生长，或生长很慢，目标蛋白的表达量会下降；在EBY100诱导表达培养基中添加1-2%的棉子糖可以促进酵母生长，提高目标蛋白的表达量。
6. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
7. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃ 48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃ 48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃ 60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺/四缺平板平板29℃ 80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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EBY100 文库电转感受态细胞 |
YEL1110S |
5×400ul |
YB溶液 50ml×1 |
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| YEL1110M | 20×400ul | YB溶液 50ml×4 |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100 Elec-Library Competent Cell为构建酵母文库用电转感受态细胞，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量YB溶液（0.45um过滤除菌）放30度预热，每管感受态准备10ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的EBY100电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入预冷的目的质粒2-15ug (加入DNA的体积不超过40ul，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.5kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预热的YB溶液，转移到无菌的50ml离心管中，再加入1ml YB溶液清洗电转杯并转移到离心管中，补加8ml YB溶液，30℃ 250rpm 摇菌1.5h。
6. 3000 rpm离心 2 min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化, 加入质粒DNA的体积不超过40ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但是由此计算的转化效率会下降。
3. 在进行EBY100的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖或同时加入2%的半乳糖和棉子糖。
4. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，YNB-CAA Medium(with galactose)，也可以使用SGR-CAA Medium（同时添加了半乳糖和棉子糖，目标蛋白的诱导效果更好）。
5. 棉子糖在EBY100菌株诱导表达时的作用：葡萄糖是最好的酵母碳源，利用率高，生长速度快，在葡萄糖存在时酵母优先利用葡萄糖，但是葡萄糖与半乳糖拮抗，所以在加入半乳糖诱导目的蛋白表达时要去除培养基中的葡萄糖；虽然有一些文献报道半乳糖可以同时作为半乳糖启动子的诱导剂和碳源使用，但在实际使用过程中酵母对半乳糖的同化能力很弱，若培养基中只含有半乳糖，酵母几乎不能生长，或生长很慢，目标蛋白的表达量会下降；在EBY100诱导表达培养基中添加1-2%的棉子糖可以促进酵母生长，提高目标蛋白的表达量。
6. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
7. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃ 48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃ 48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃ 60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺/四缺平板平板29℃ 80-90h培养可见直径1 mm克隆。
