酿酒酵母感受态细胞
产品规格（CAT#: YEL1020）
Y187 Elec-Library Cell: 400μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
YB溶液（0.45um过滤除菌）: 100ml 保存： 4℃（3个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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Y187 文库电转感受态细胞 |
YEL1020S |
5×400ul |
YB溶液 100ml×1 |
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| YEL1020M | 20×400ul | YB溶液 100ml×4 |
MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1
产品说明
Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子 (G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187 Elec-Library Competent Cell为构建酵母文库用电转感受态细胞，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>1×106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量YB溶液（0.45um过滤除菌）放30度预热，每管感受态准备10ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的Y187电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入预冷的目的质粒2-15ug (加入DNA的体积不超过40ul，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.5kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预热的YB溶液，转移到无菌的50ml离心管中，再加入1ml YB溶液清洗电转杯并转移到离心管中，补加8ml YB溶液，30℃ 250rpm 摇菌1.5h。
6. 3000 rpm离心 2 min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，加入质粒DNA的体积不超过40ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但是由此计算的转化效率会下降。
3. Y187酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
产品配套 |
说明书下载 |
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Y187 文库电转感受态细胞 |
YEL1020S |
5×400ul |
YB溶液 100ml×1 |
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| YEL1020M | 20×400ul | YB溶液 100ml×4 |
MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1
产品说明
Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子 (G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187 Elec-Library Competent Cell为构建酵母文库用电转感受态细胞，经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>1×106 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量YB溶液（0.45um过滤除菌）放30度预热，每管感受态准备10ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的Y187电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入预冷的目的质粒2-15ug (加入DNA的体积不超过40ul，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.5kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预热的YB溶液，转移到无菌的50ml离心管中，再加入1ml YB溶液清洗电转杯并转移到离心管中，补加8ml YB溶液，30℃ 250rpm 摇菌1.5h。
6. 3000 rpm离心 2 min弃上清，加入1-10ml 0.9%的氯化钠重悬涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，加入质粒DNA的体积不超过40ul，文库质粒纯度越高越好。
2. 文库用酵母感受态的转化效率数据是在加入不超过100ng标准质粒的试验中获得，若加入质粒过多，虽然得到的菌落数会增加，但是由此计算的转化效率会下降。
3. Y187酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
