毕赤酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: PC1004）
KM71H Chemically Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
pPICZ A (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
PD Buffer: 15ml 保存： 4℃（3个月）
PN Buffer 18ml 保存： 4℃（3个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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KM71H 感受态细胞 |
PC1004S |
10×100ul |
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| PC1004M | 50×100ul |
基因型
aox1::ARG4, arg4
表型（Phenotype）
MutS, Arg+
产品说明
KM71H菌株是invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。KM71H可以表达HIS4基因，不可利用营养缺陷培养基筛选重组成功的阳性菌落；pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等具有Zeocin抗性基因的毕赤酵母表达质粒可使用100ug/ml的Zeocin或盐酸博来霉素进行筛选。KM71H毕赤酵母的表型为MutS, Arg+，Arg+表示KM71H的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因同时破坏了AOX1基因，产生了MutS表型；MutS表示KM71H的AOX1基因功能被破坏（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为MutS的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质）。KM71H化转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPICZ A质粒（3.3kb，ZeocinR in E.coli/ Pichia pastoris）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的KM71H感受态细胞，依次加入预冷的线性化质粒2-10 µg(加入DNA的体积不超过10ul，DNA纯度越高越好)，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PD Buffer 1.4ml并吸打几次混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，加入PN Buffer 1.4ml重悬，离心 30s弃上清。
5. 加入PN Buffer 0.3ml重悬，若平板较多可直接涂板；若平板较少，可5000 rpm离心30秒，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基配制
含有Zeocin抗性基因的毕赤酵母表达质粒转化KM71H，可用YPDS+Zeocin/盐酸博莱霉素筛选，1L配方如下:
• 蛋白胨（peptone） 20g
• 酵母提取物（yeast extract） 10g
• 山梨醇（sorbitol） 182.2 g
补水到 950ml，用盐酸调PH到 7.0±0.2；
• 琼脂粉（agar） 20g(for plates only)
121℃，20 min高压灭菌；待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的50% 葡萄糖 40ml。
• 加入100 mg/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素母液到培养基中，终浓度100 ug/ml，倒平板。
• 含有Zeocin/盐酸博莱霉素的YPDS可以在4°C保存两周（半衰期约10-15天）。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPICZ A质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SacI进行线性化。
3. 关于Zeocin/盐酸博莱霉素的使用浓度：Zeocin抗性基因单拷贝插入毕赤酵母基因组可用100 ug/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素浓度筛选；多拷贝整合可增加毕赤酵母对Zeocin/盐酸博莱霉素的抗性水平，每增加一个拷贝，Zeocin/盐酸博莱霉素的筛选浓度可增加200 ug/ml，所以为了筛选到高拷贝的蛋白表达框可增加抗生素的使用浓度到500, 1000, 甚至2000 μg/ml。
4. KM71H酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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KM71H 感受态细胞 |
PC1004S |
10×100ul |
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| PC1004M | 50×100ul |
基因型
aox1::ARG4, arg4
表型（Phenotype）
MutS, Arg+
产品说明
KM71H菌株是invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。KM71H可以表达HIS4基因，不可利用营养缺陷培养基筛选重组成功的阳性菌落；pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等具有Zeocin抗性基因的毕赤酵母表达质粒可使用100ug/ml的Zeocin或盐酸博来霉素进行筛选。KM71H毕赤酵母的表型为MutS, Arg+，Arg+表示KM71H的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因同时破坏了AOX1基因，产生了MutS表型；MutS表示KM71H的AOX1基因功能被破坏（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为MutS的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质）。KM71H化转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPICZ A质粒（3.3kb，ZeocinR in E.coli/ Pichia pastoris）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的KM71H感受态细胞，依次加入预冷的线性化质粒2-10 µg(加入DNA的体积不超过10ul，DNA纯度越高越好)，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PD Buffer 1.4ml并吸打几次混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，加入PN Buffer 1.4ml重悬，离心 30s弃上清。
5. 加入PN Buffer 0.3ml重悬，若平板较多可直接涂板；若平板较少，可5000 rpm离心30秒，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基配制
含有Zeocin抗性基因的毕赤酵母表达质粒转化KM71H，可用YPDS+Zeocin/盐酸博莱霉素筛选，1L配方如下:
• 蛋白胨（peptone） 20g
• 酵母提取物（yeast extract） 10g
• 山梨醇（sorbitol） 182.2 g
补水到 950ml，用盐酸调PH到 7.0±0.2；
• 琼脂粉（agar） 20g(for plates only)
121℃，20 min高压灭菌；待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的50% 葡萄糖 40ml。
• 加入100 mg/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素母液到培养基中，终浓度100 ug/ml，倒平板。
• 含有Zeocin/盐酸博莱霉素的YPDS可以在4°C保存两周（半衰期约10-15天）。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPICZ A质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SacI进行线性化。
3. 关于Zeocin/盐酸博莱霉素的使用浓度：Zeocin抗性基因单拷贝插入毕赤酵母基因组可用100 ug/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素浓度筛选；多拷贝整合可增加毕赤酵母对Zeocin/盐酸博莱霉素的抗性水平，每增加一个拷贝，Zeocin/盐酸博莱霉素的筛选浓度可增加200 ug/ml，所以为了筛选到高拷贝的蛋白表达框可增加抗生素的使用浓度到500, 1000, 甚至2000 μg/ml。
4. KM71H酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。
