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KM71  感受态细胞	PC1003S	10×100ul
	PC1003M	50×100ul

基因型

his4, aox1::ARG4, arg4

表型（Phenotype）

Mut^S, Arg⁺, His^–

产品说明

KM71菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。KM71是组氨酸缺陷型菌株，基因组中组氨酸脱氢酶（His4）基因位点产生突变，自身无法合成组氨酸；部分携带HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPIC3.5K/pPIC9K/pAO815等）可以表达HIS4基因，与KM71互补，通过组氨酸缺陷培养基来筛选整合成功的阳性转化子；其他无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等）也可通过Zeocin或盐酸博来霉素筛选阳性转化子。KM71毕赤酵母的表型为Mut^S, Arg⁺, His^–，His^–表示KM71是组氨酸缺陷型菌株，不能在组氨酸缺陷型培养基中生长；Arg⁺表示KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因同时破坏了AOX1基因，产生了Mut^S表型；Mut^S表示KM71的AOX1基因功能被破坏（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut⁺型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为Mut^S的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut⁺还是Mut^S作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut⁺型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut⁺少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质）。KM71化转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPIC9K质粒（9.3kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。

2. 取100 µl冰上融化的KM71感受态细胞，依次加入预冷的线性化质粒2-10 µg(加入DNA的体积不超过10ul，DNA 纯度越高越好)，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PD Buffer 1.4ml并吸打几次混匀，30℃水浴60 min (30 min时翻转6-8次混匀)。

3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，加入PN Buffer 1.4ml重悬，离心 30s弃上清。

5. 加入PN Buffer 0.3ml重悬，若平板较多可直接涂板；若平板较少，可5000 rpm离心30秒，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到合适的营养缺陷型筛选平板或含相应抗生素的筛选平板上，平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。

筛选培养基配制

1. KM71可用组氨酸缺陷培养基筛选阳性菌落，常用培养基为SD/–His固体培养基或MD培养基，配方如下:

2. 无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒转化KM71，可用YPDS+Zeocin/盐酸博莱霉素筛选，1L配方如下:

• 蛋白胨（peptone）                           20g

• 酵母提取物（yeast extract）              10g

• 山梨醇（sorbitol）                       182.2 g

补水到 950ml，用盐酸调PH到       7.0±0.2；

     • 琼脂粉（agar）                        20g(for plates only)

       121℃，20 min高压灭菌；待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的50% 葡萄糖40 ml。 

      • 加入100 mg/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素母液到培养基中，终浓度100 ug/ml，倒平板。

      • 含有Zeocin/盐酸博莱霉素的YPDS可以在4°C保存两周（半衰期约10-15天）。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。

2. pPIC9K质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SalI进行线性化。

3. 关于Zeocin/盐酸博莱霉素的使用浓度：Zeocin抗性基因单拷贝插入毕赤酵母基因组可用100 ug/ml的Zeocin/盐酸博莱霉素浓度筛选；多拷贝整合可增加毕赤酵母对Zeocin/盐酸博莱霉素的抗性水平，每增加一个拷贝，Zeocin/盐酸博莱霉素的筛选浓度可增加200 ug/ml，所以为了筛选到高拷贝的蛋白表达框可增加抗生素的使用浓度到500, 1000, 甚至2000 μg/ml。

4. KM71酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降。