发根农杆菌感受态细胞
产品规格 （CAT#: AC1083）
K599(pSoup-p19) Competent Cell： 100μl/支
pGS2(control vector, 10ng/μl) 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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K599(pSoup-p19) 感受态细胞 |
AC1083S |
10×100ul |
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| AC1083M | 50×100ul | ||
| AC1083L | 100×100ul |
基因型
Agrobacterium rhizogenes (strR) pRi2659 (agropine type)(pSoup-p19-tetR)
产品说明
P19蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的RNA沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片，拟南芥叶片，番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链霉素抗性。在K599菌株中转入help质粒：pSoup-p19即为K599((pSoup-p19)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。本公司生产的K599((pSoup-p19)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2质粒（4445bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 取-80℃保存的K599(pSoup-p19)感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），快速拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 冰浴中拿出放室温，加入700μl 无抗生素的TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时。
4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3 天。K599(pSoup-p19)液体摇菌时容易出现絮状物，离心后的菌块用枪吹散即可，不影响使用。
5. K599(pSoup-p19)菌株最好使用TY培养基，若使用LB培养基，在抗生素筛选时平板底部容易产生一层菌膜。
6. K599(pSoup-p19)菌株对壮观霉素不敏感，若转化壮观霉素抗性的质粒，必须使用TY培养基，同时壮观霉素使用浓度为100-150 ug/ml，壮观霉素浓度低于100 ug/ml时，会产生糊板现象，很难长出阳性菌落；壮观霉素浓度为100-150 ug/ml时，会长出正常的阳性菌落，此时平板底部可能会有一薄层菌膜，这是正常现象，不影响试验。
附言：
1. 农杆菌液体摇菌产生絮状沉淀的根源是胞外多糖（纤维素、UPP 单极多糖、curdlan 等）合成能力不同；胞外多糖会把菌体互相粘连，形成肉眼可见的絮状沉淀；多糖合成弱的菌株，没有絮状物；多糖合成强的菌株，细胞间容易发生黏连，易产生絮状沉淀。
2. 不同菌产生絮状沉淀的能力不同：发根农杆菌>根癌农杆菌>大肠杆菌。发根/根癌农杆菌不同菌株表型差异较大，K599、Lba4404更容易出现絮状菌体沉淀。
3. 农杆菌（根癌/发根）在自然生境中必须牢固附着在植物表皮/伤口细胞，才能启动 T-DNA 转移。所以农杆菌进化出附着植物细胞、表皮的细胞极性粘附多糖、纤维素微丝等结构，这些细胞结构导致农杆菌在液体摇菌时更容易黏连，聚集成絮状沉淀。
4. 影响农杆菌产生絮状沉淀的因素有：转速（转速越高越不易产生沉淀，一般设置200-220rpm）；菌液浓度（浓度越高，越容易产生沉淀，一般要求菌液OD600值不超过2.0；生长时期：对数期胞外多糖分泌量低，菌液最均匀，絮团最少，衰退期：更易产生沉淀。
● K599相关抗生素配方及工作浓度
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
100 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素(carb) |
链霉素(strep) |
利福平(rif) |
氯霉素(cam) |
硫酸卡那霉素(kan) |
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Ar.A4 |
S |
S |
S |
S |
R |
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MSU440 |
S |
R |
S |
S |
S |
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Ar.Qual |
S |
R |
S |
R |
S |
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C58C1 |
S |
R |
R |
S |
S |
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ATCC15834 |
S |
S |
S |
S |
S |
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K599 |
S |
R |
S |
S |
S |
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Ar.1193 |
R |
R |
R |
S |
S |
● TY配方（1L）（唯地CAT#：CM2210）
Tryptone 5g，Yeast extract 3g，补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌，加入无菌的10ml 1M的氯化钙水溶液，即为TY Broth液体培养基；若要配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。
4. K599((pSoup-p19)具有链霉素、四环素抗性，不可用于具有链霉素、四环素抗性质粒的转化。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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K599(pSoup-p19) 感受态细胞 |
AC1083S |
10×100ul |
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| AC1083M | 50×100ul | ||
| AC1083L | 100×100ul |
基因型
Agrobacterium rhizogenes (strR) pRi2659 (agropine type)(pSoup-p19-tetR)
产品说明
P19蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的RNA沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片，拟南芥叶片，番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链霉素抗性。在K599菌株中转入help质粒：pSoup-p19即为K599((pSoup-p19)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。本公司生产的K599((pSoup-p19)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2质粒（4445bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 取-80℃保存的K599(pSoup-p19)感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），快速拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 冰浴中拿出放室温，加入700μl 无抗生素的TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时。
4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3 天。K599(pSoup-p19)液体摇菌时容易出现絮状物，离心后的菌块用枪吹散即可，不影响使用。
5. K599(pSoup-p19)菌株最好使用TY培养基，若使用LB培养基，在抗生素筛选时平板底部容易产生一层菌膜。
6. K599(pSoup-p19)菌株对壮观霉素不敏感，若转化壮观霉素抗性的质粒，必须使用TY培养基，同时壮观霉素使用浓度为100-150 ug/ml，壮观霉素浓度低于100 ug/ml时，会产生糊板现象，很难长出阳性菌落；壮观霉素浓度为100-150 ug/ml时，会长出正常的阳性菌落，此时平板底部可能会有一薄层菌膜，这是正常现象，不影响试验。
附言：
1. 农杆菌液体摇菌产生絮状沉淀的根源是胞外多糖（纤维素、UPP 单极多糖、curdlan 等）合成能力不同；胞外多糖会把菌体互相粘连，形成肉眼可见的絮状沉淀；多糖合成弱的菌株，没有絮状物；多糖合成强的菌株，细胞间容易发生黏连，易产生絮状沉淀。
2. 不同菌产生絮状沉淀的能力不同：发根农杆菌>根癌农杆菌>大肠杆菌。发根/根癌农杆菌不同菌株表型差异较大，K599、Lba4404更容易出现絮状菌体沉淀。
3. 农杆菌（根癌/发根）在自然生境中必须牢固附着在植物表皮/伤口细胞，才能启动 T-DNA 转移。所以农杆菌进化出附着植物细胞、表皮的细胞极性粘附多糖、纤维素微丝等结构，这些细胞结构导致农杆菌在液体摇菌时更容易黏连，聚集成絮状沉淀。
4. 影响农杆菌产生絮状沉淀的因素有：转速（转速越高越不易产生沉淀，一般设置200-220rpm）；菌液浓度（浓度越高，越容易产生沉淀，一般要求菌液OD600值不超过2.0；生长时期：对数期胞外多糖分泌量低，菌液最均匀，絮团最少，衰退期：更易产生沉淀。
● K599相关抗生素配方及工作浓度
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
100 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素(carb) |
链霉素(strep) |
利福平(rif) |
氯霉素(cam) |
硫酸卡那霉素(kan) |
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Ar.A4 |
S |
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MSU440 |
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Ar.Qual |
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C58C1 |
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ATCC15834 |
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K599 |
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Ar.1193 |
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● TY配方（1L）（唯地CAT#：CM2210）
Tryptone 5g，Yeast extract 3g，补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌，加入无菌的10ml 1M的氯化钙水溶液，即为TY Broth液体培养基；若要配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。
4. K599((pSoup-p19)具有链霉素、四环素抗性，不可用于具有链霉素、四环素抗性质粒的转化。
引用唯地生物产品SCI文献统计信息
