酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1110）
EBY100 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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EBY100 感受态细胞 |
YC1110S |
10×100ul |
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| YC1110M | 50×100ul |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EBY100感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化, 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 在进行EBY100酵母菌的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖。
3. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with
Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，也可以用YNB-CAA Medium(with galactose)。
4. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
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EBY100 感受态细胞 |
YC1110S |
10×100ul |
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| YC1110M | 50×100ul |
基因型
MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL
产品说明
EBY100菌株是 Invitrogen公司开发的酵母展示用菌株，MATa型，与pYD1质粒配套使用，可直接转化质粒进行蛋白展示试验；Transformation marker为：leu2，trp1。EBY100-pYD1酵母展示系统通过酿酒酵母的a凝集素受体（a- agglutinin receptor）将目标蛋白展示在细胞表面，方便后期筛选。其基本原理为：a凝集素受体由AGA1和AGA2 两个亚基组成，AGA1蛋白(725个氨基酸)由EBY100细胞合成，分泌到细胞外，在细胞外基质中与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价结合，AGA2蛋白( 69个氨基酸)可以通过两个二硫键结合到AGA1蛋白上；将目标蛋白构建到pYD1质粒上，与AGA2蛋白融合表达，AGA2蛋白在N端，目标蛋白在C端，当含有pYD1质粒的EBY100酵母菌在含有半乳糖，同时不含葡萄糖的培养基中诱导表达时可以表达出AGA2-target protein融合蛋白，该融合蛋白通过AGA2结合到EBY100酵母细胞表面的AGA1蛋白上进而将目标蛋白展示在酵母表面。EBY100感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒（7303bp，KanR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的EBY100感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPD (1L) (唯地CAT#：YM1010):
Peptone 20g Yeast extract 10g 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤 的40% 葡萄糖 50 ml。
③ YNB-CAA Medium (1L) 0.67% YNB (with ammonium sulfate, without amino acids) 0.5% Casamino acids (-ade, -ura, -trp) 2% glucose or galactose
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化, 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 在进行EBY100酵母菌的诱导表达时，要去除培养基中的葡萄糖，加入2%的半乳糖。
3. 转化pYD1质粒到EBY100菌株后的筛选平板可以用SD/-Trp/-Ura，也可以用Minimal Dextrose Plates (with
Amino Acids) ；诱导目的蛋白表达，可以用SG/-Trp/-Ura，也可以用YNB-CAA Medium(with galactose)。
4. EBY100酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
