酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1100）
MaV203 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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MaV203 感受态细胞 |
YC1100S |
10×100ul |
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| YC1100M | 50×100ul |
基因型
MATα, leu2-3,112; trp1-901; his3∆200; ade2-101; cyh2R; can1R; gal4∆; gal80∆; GAL1::lacZ; HIS3UASGAL1:: HIS3 LYS2; SPAL10 UASGAL1::URA3
产品说明
MaV203 菌株是利用酵母体内重组酶构建质粒的菌株，MATα型，可直接转化线性化质粒和基因片段；可以用于筛选标记为TRP，LEU，URA的酵母质粒的转化。MaV203 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
PCR引物设计方法（例：PGADT7质粒Ecor1/Bamh1酶切线性化质粒）
30-nt 同源序列 上游引物
5` --GAT TAC GCC ATA TGG CCA TGG AGG CCA GTG Gene specific sequences---3` 质粒序列
5` --GAT TAC GCC ATA TGG CCA TGG AGG CCA GTG GATCCAA CGA GCT CGA GCT GCA GAT GAA TCG TAG--3`
3` --CTA ATG CGG TAT ACC GGT ACC TCC GGT CACTTAA GTT GCT CGA GCT CGA CGT CTA CTT AGC ATC---5`
3`---Gene specific sequences GTT GCT CGA GCT CGA CGT CTA CTT AGC ATC---5`
质粒序列 下游引物 30-nt 同源序列
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的MaV203 感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将离心管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂相应的SD-/氨基酸缺陷型板，29℃培养48-96 h。
6. 平板长出的菌落做菌落PCR（为提高成功率，菌落PCR产物最好控制在300-500bp），PCR正确的菌落接菌提质粒，酵母提取的质粒转化高效率的商业化大肠杆菌化学感受态（比如DH5a，TOP10等），再从大肠杆菌中提质粒酶切或测序鉴定，鉴定正确的质粒放-20度可长期保存。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。 |
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. MaV203 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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MaV203 感受态细胞 |
YC1100S |
10×100ul |
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基因型
MATα, leu2-3,112; trp1-901; his3∆200; ade2-101; cyh2R; can1R; gal4∆; gal80∆; GAL1::lacZ; HIS3UASGAL1:: HIS3 LYS2; SPAL10 UASGAL1::URA3
产品说明
MaV203 菌株是利用酵母体内重组酶构建质粒的菌株，MATα型，可直接转化线性化质粒和基因片段；可以用于筛选标记为TRP，LEU，URA的酵母质粒的转化。MaV203 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>106 cfu/μg DNA。
PCR引物设计方法（例：PGADT7质粒Ecor1/Bamh1酶切线性化质粒）
30-nt 同源序列 上游引物
5` --GAT TAC GCC ATA TGG CCA TGG AGG CCA GTG Gene specific sequences---3` 质粒序列
5` --GAT TAC GCC ATA TGG CCA TGG AGG CCA GTG GATCCAA CGA GCT CGA GCT GCA GAT GAA TCG TAG--3`
3` --CTA ATG CGG TAT ACC GGT ACC TCC GGT CACTTAA GTT GCT CGA GCT CGA CGT CTA CTT AGC ATC---5`
3`---Gene specific sequences GTT GCT CGA GCT CGA CGT CTA CTT AGC ATC---5`
质粒序列 下游引物 30-nt 同源序列
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的MaV203 感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将离心管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂相应的SD-/氨基酸缺陷型板，29℃培养48-96 h。
6. 平板长出的菌落做菌落PCR（为提高成功率，菌落PCR产物最好控制在300-500bp），PCR正确的菌落接菌提质粒，酵母提取的质粒转化高效率的商业化大肠杆菌化学感受态（比如DH5a，TOP10等），再从大肠杆菌中提质粒酶切或测序鉴定，鉴定正确的质粒放-20度可长期保存。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。 |
② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. MaV203 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
