酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1080）
R5421 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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R5421 感受态细胞 |
YC1080S |
10×100ul |
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| YC1080M | 50×100ul |
基因型
MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64
产品说明
R5421酿酒酵母菌株为K+/钾离子缺陷型菌株，在文献中也称为CY162，MATα型，多用于K+/钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于K+/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为：ura3，leu2，该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中国正常生长，在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5mM，R5421（CY162）细胞停止生长。R5421感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min，再次放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min以上。
2. 取100 µl冰上融化的R5421感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. R5421酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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R5421 感受态细胞 |
YC1080S |
10×100ul |
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| YC1080M | 50×100ul |
基因型
MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64
产品说明
R5421酿酒酵母菌株为K+/钾离子缺陷型菌株，在文献中也称为CY162，MATα型，多用于K+/钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于K+/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为：ura3，leu2，该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中国正常生长，在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢，当培养基中KCl浓度低于0.5mM，R5421（CY162）细胞停止生长。R5421感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒（7988bp，AmpR）检测转化效率>103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min，再次放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min以上。
2. 取100 µl冰上融化的R5421感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
培养基配制
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① YPDA (1L) (唯地CAT#：YM1020): Tryptone 20g Yeast extract 10g 0.2% adenine 15ml 补水到 950ml，用盐酸调PH到6.5； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌； 待培养基温度降到55℃时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml。
③ 0.2% adenine (0.5L) (唯地CAT#：YC6030) Adenine 1g； 补水到0.5L；溶解后高压灭菌或0.22µm 滤膜过滤除菌。
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② SD medium (1L)(唯地CAT#：YM3101-YM3611): Yeast Nitrogen base 6.7g 葡萄糖 20g Dropout 适量（按说明书） 补水到1L，调PH至5.8； Agar 20g(for plates only) 121℃，15 min高压灭菌。 |
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. R5421酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
