发根农杆菌感受态细胞
产品规格 （CAT#: AE1080）
K599 Electro： 50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )： 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转K599 感受态细胞 |
AE1080S |
10×50ul |
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| AE1080M | 50×50ul |
基因型
Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)
产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链霉素抗性。唯地生物开发的K599电转感受态经特殊工艺制作，特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒（12739bp，KanR）检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒（40kb，KanR）检测转化效率>5×103 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
注意
1. K599菌株最好使用TY培养基，若使用LB培养基，在抗生素筛选时平板底部容易产生一层菌膜。
2. K599菌株对壮观霉素不敏感，若转化壮观霉素抗性的质粒，必须使用TY培养基，同时壮观霉素使用浓度为100-150ug/ml，壮观霉素浓度低于100ug/ml时，会产生糊板现象，很难长出阳性菌落；壮观霉素浓度为100-150ug/ml时，会长出正常的阳性菌落，此时平板底部可能会有一薄层菌膜，这是正常现象，不影响试验，挑菌时挑阳性菌落即可。
● K599相关抗生素配方及工作浓度：
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
100 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素(carb) |
链霉素(strep) |
利福平(rif) |
氯霉素(cam) |
硫酸卡那霉素(kan) |
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Ar.A4 |
S |
S |
S |
S |
R |
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MSU440 |
S |
R |
S |
S |
S |
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Ar.Qual |
S |
R |
S |
R |
S |
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C58C1 |
S |
R |
R |
S |
S |
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ATCC15834 |
S |
S |
S |
S |
S |
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K599 |
S |
R |
S |
S |
S |
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Ar.1193 |
R |
R |
R |
S |
S |
● TY配方（1L）（唯地CAT#：CM2210）
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。
4. K599具有链霉素抗性，不可用于具有链霉素抗性质粒的转化。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转K599 感受态细胞 |
AE1080S |
10×50ul |
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| AE1080M | 50×50ul |
基因型
Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)
产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链霉素抗性。唯地生物开发的K599电转感受态经特殊工艺制作，特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒（12739bp，KanR）检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒（40kb，KanR）检测转化效率>5×103 cfu/μg DNA。
常规操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
注意
1. K599菌株最好使用TY培养基，若使用LB培养基，在抗生素筛选时平板底部容易产生一层菌膜。
2. K599菌株对壮观霉素不敏感，若转化壮观霉素抗性的质粒，必须使用TY培养基，同时壮观霉素使用浓度为100-150ug/ml，壮观霉素浓度低于100ug/ml时，会产生糊板现象，很难长出阳性菌落；壮观霉素浓度为100-150ug/ml时，会长出正常的阳性菌落，此时平板底部可能会有一薄层菌膜，这是正常现象，不影响试验，挑菌时挑阳性菌落即可。
● K599相关抗生素配方及工作浓度：
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
100 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
● 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素(carb) |
链霉素(strep) |
利福平(rif) |
氯霉素(cam) |
硫酸卡那霉素(kan) |
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Ar.A4 |
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S |
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MSU440 |
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Ar.Qual |
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C58C1 |
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ATCC15834 |
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Ar.1193 |
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● TY配方（1L）（唯地CAT#：CM2210）
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。
4. K599具有链霉素抗性，不可用于具有链霉素抗性质粒的转化。
