2× Gibson Assembly Nova Mix - 上海唯地生物技术有限公司

分子克隆

分子生物学

2× Gibson Assembly Nova Mix

产品说明

2× Gibson Assembly Nova Mix是唯地生物全新开发的Gibson同源重组克隆试剂盒，Assembly Nova Mix中预混了Gibson相关酶及重组反应所需缓冲液，并添加了唯地生物开发的独特的小分子重组酶、重组增强子、和稳定型分子伴侣，可显著提高重组事件成功率。配套唯地生物开发的DH5α-Rec1 重组增强型感受态效果更优。

产品规格

货号	规格	目录价
A2011S	20 T	240
A2011M	50 T	540
A2011L	250 T	2160

产品特色

特点	配套普通DH5α、TOP10/T1克隆感受态	配合DH5α-Rec1 重组型感受态
多片段	1-8个	1-12个
长片段连接	0.1-12kb	0.1-42kb
快速	最快5分钟完成重组反应	最快5分钟完成重组反应
应用范围广	适用于任何载体，兼顾粘性和平末端	适用于任何载体，兼顾粘性和平末端

试剂盒组成部分

成分	货号	体积	保存条件/时间
2× Gibson Assembly Nova Mix	A2011S/M/L	0.2ml/0.5ml/0.5ml×5	-20℃/24个月
800 bp insert (PCR产物，含J23107 promoter 和mCherry ，20 ng/μl)	A2015S/M/L	20ul/20ul /20ul×5	-20℃/24个月
pUC19 control vector，linearized (50 ng/μl，Amp+)	A2016S/M/L	20ul /20ul/20ul×5	-20℃/24个月

常规实验流程

图 1. 常规实验流程

1.1. PCR获取插入片段引物设计（酶切方法获得线性化载体）

1.2. PCR扩增操作

（1）推荐使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，以确保扩增片段的序列准确性。避免使用Taq等不具有3’-5’校对活性的聚合酶，以减少序列错误。

（2）PCR产物中可能携带大量未切割的质粒模板，建议在Gibson Assembly之前用Dpn I限制性内切酶处理PCR产物，以去除甲基化的模板质粒DNA。Dpn I处理条件：37°C孵育15-30分钟。

1.3. 酶切获取线性化片段（一般为载体）

限制性内切酶酶切是在载体的特定位点进行切割，产生线性化的载体。

（1）选择限制性内切酶

优先使用两种不同的限制性内切酶进行双酶切，可显著降低未切割载体的背景。也可使用IIS类酶，如BspQI或BsaI等。如果必须使用单酶切，应避免使用产生四碱基突出端且富含C/G的酶（如产生CCGG突出的酶），因为这类突出端可能自行退火重新环化。

（2）酶切体系：

根据厂家说明书配制酶切体系，一般包含：DNA 1-5 μg、限制性内切酶 10-20 U、相应缓冲液、补充ddH₂O至总体积50 μL。推荐使用High Fidelity（HF）限制性内切酶以避免星号活性。

2.1. 片段回收

琼脂糖凝胶回收是通过凝胶电泳分离目的DNA片段，具体方法参考回收试剂盒说明书。

重组反应与操作

1.片段用量粗略计算

试剂盒适用的载体用量为0.03 pmol，最适插入片段为0.06 pmol（摩尔比为1:2），粗略计算如下：

最适载体用量 = [0.02×载体碱基数] ng (0.03 pmol)

最适片段用量 = [0.04×插入片段碱基数] ng (0.06 pmol)

例如1k的片段插入5k的载体中，则载体最适用量=0.02×5000=100 ng，插入片段的最适用量=0.04×1000=40 ng

当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体，克隆载体当做插入片段进行计算。

2.反应体系的配制

组分	用量	终浓度
2X Gibson Assembly Nova Mix	10 μL	1X
DNA片段（载体 + 插入片段）	X μL*	见上表
无核酸酶水 (ddH₂O)	补至20 μL	-
总体积20 μL-	20 μL	-

*未纯化的PCR产物总体积不应超过Gibson Assembly反应总体积的20%（即不超过4 μL）。

3.反应条件

（1）2-3片段（1插入片段）组装：50°C孵育15~30分钟。

（2）4-6片（3-5插入片段）段组装：50°C孵育60分钟。

（3）反应后可将样品置于冰上或-20°C保存，用于后续转化大肠杆菌感受态。