质粒图谱与基础信息

质粒简介

UBQ:RUBY（Addgene 质粒编号：160909）：是来自addgene的一款高效、可视化、适用于植物遗传转化的组成型表达质粒，以经典植物表达载体pHDE为骨架，以玉米 UBIQUITIN（ZmUbi）泛素组成型启动子驱动 RUBY 甜菜红素合成模块，支持农杆菌介导的植物瞬时转化与稳定遗传转化。与 35S-RUBY 相比，ZmUbi 启动子在单子叶、双子叶植物均具备强组成型表达活性，在植株叶、茎、花等多种组织均可驱动 RUBY 高效表达，整个植株呈现红色表型，适合多物种遗传转化的阳性可视化筛选、基因表达监测。UBQ:RUBY具有以下特点：

1、核心结构与显色原理：质粒核心表达元件为泛素启动子：RUBY报告基因模块，其中启动子为玉米 UBIQUITIN（ZmUbi）泛素组成型启动子，可在植物几乎所有组织、不同发育阶段持续高效驱动下游基因表达，不受时空条件限制。RUBY是新型无损可视化报告系统，通过2A肽序列串联融合CYP76AD1、DODA、糖基转移酶三个关键功能基因，形成单顺反子融合表达框架。

2、显色特异性强、对比度高：将 UBQ:RUBY 转入农杆菌，侵染拟南芥（浸花法）、烟草叶片（瞬时浸润），转化组织积累甜菜红素，肉眼可见紫红色；T-DNA 插入的转基因植株各组织均可观察显色表型，可用于稳定株系肉眼初筛，无需荧光设备、无需底物染色，特别适合不同植物遗传转化体系的摸索。

3、稳定性与通用性高：泛素启动子表达活性稳定，不受植物生长周期、环境条件轻微波动影响；载体骨架适配农杆菌介导的植物遗传转化体系，适配性强、转化效率稳定，重复性好。

4、无损可视化筛选：区别于GUS、GFP等传统报告系统，无需切片染色、无需荧光显微镜观测，活体植株即可直接观察显色结果，可实现大规模样本快速初筛，大幅提升实验效率。

5、二元载体骨架：采用 pHDE 植物转化骨架载体（农杆菌 T-DNA 二元载体，潮霉素作为植物筛选标记；细菌抗性为壮观霉素）。

产品说明

1，本公司质粒均为质粒大提试剂盒提取质粒，因不同质粒的复制子不同，质粒浓度有差异，收到质粒后可直接酶切用于构建载体。

2，随质粒同时提供一管含有质粒的DH5α-m甘油菌种，收到菌种后可直接放-80度长期保存，也可用交叉划线法划线后挑单菌落接菌，大量扩繁质粒。DH5α-m菌株兼顾DH5α和DH10B菌株的优点，在DH5α基因组中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突变使得DH5α-m菌株中保存的质粒更稳定，有利于质粒大量扩繁。

3，质粒序列可在产品页面下载snapgene文件或text文件。

菌株交叉划线法

1，客户收到菌株后，不可直接吸取菌液接种扩繁。应先对菌种进行复壮，待长出单菌落后挑单菌落接菌扩繁；复壮方法如下：在超净台打开盖子，用接种环沾取少量甘油菌液采用交叉划线法（图1）在含相应抗生素的LB平板表面轻轻划线(注意：不要刺破培养基)，将平板封口后放培养箱培养15-20h，即可长出单菌落。

2，交叉划线法：划线的目的是经过几次不连续划线达到梯度稀释菌液的效果，保证能长出单菌落。具体步骤如下：

A，-80度取出的甘油菌应在超净台打开盖子，立即在表面挑取菌液/菌块划线，不用等融化后划线，固体状态时即可用接种环挑取划线，操作要点是“快速操作，立即划线”，目的是最大限度减少温度波动对菌种造成的“冷休克”和冰晶物理损伤；如果收到的是液体甘油菌，可直接划线，在超净台打开盖子用接种环沾取少量甘油菌液划线。

B，用金属接种环灼烧待冷却后划线，注意不要污染，图1所示为标准的五段交叉划线法，分五个区，每个区划三条直线，第1、2区可共用一个接种环，划好1，2区后换一个新接种环划第3区，再换一个新接种环划第4区，再换一个新接种环划第5区，每一次换接种环划线要经过前面划线区的划线痕迹，这样就相当于对菌种进行稀释。简易划线也可只划3个区或4个区。

图1. 五段交叉划线法示意图

注意事项

1，收到含有质粒的菌株应立即放-80度，不可放-20度保存；在4度或室温长时间存放会增加发生错误突变的概率。

2，质粒在不同实验室保存的过程中有发生突变的概率，所以实际的测序结果与数据库下载序列可能会有部分序列存在SNP或突变，只要不在核心元件发生突变或不影响质粒核心功能，一般不影响使用。