产品规格

产品内容

组分	货号	S（5 T）	M（10 T）	L（25 T）	储存温度
P1 / P2 / P3	/	各 100 mL	各 200 mL	各 500 mL	P1 2–8 ℃（加 RNase A 后）；P2、P3 室温
Dilution Buffer	/	500 mL	1000 mL	2500 mL	室温
Equilibration / Wash Buffer	/	800 mL	1600 mL	4000 mL	室温
Elution Buffer	/	150 mL	300 mL	750 mL	室温
RNase A（10 mg/mL）	GR5013	1 mL	2 mL	5 mL	–20 ℃
纯化柱（含 10 mL 填料）	CO1302	5 支	10 支	25 支	2–8 ℃，严禁冻存
TE	/	5 mL	10 mL	25 mL	2–8 ℃

     本试剂盒采用改良碱裂解法结合 DEAE 弱阴离子交换层析，专为常规硅胶膜离心柱难以胜任的大分子量质粒设计。以开放柱床、重力流为核心，全流程避免高剪切操作，可在保持大质粒完整性的前提下获得可直接用于酶切、测序、电转化与转染的 DNA。

     ▍关键控制点：① 全程禁止涡旋，仅温和颠倒混匀；② 全程使用宽口枪头；③ 上样前必须用稀释缓冲液把离子强度降下来，否则 DNA 不结合树脂。

推荐操作步骤

一、 使用前准备

● 向 P1 中加入配套 RNase A（每 100 mL P1 加 1 mL）并混匀，标注加入日期，2–8 ℃ 保存；RNase A 处理为强制步骤。

● 检查 P2 是否析出 SDS 沉淀，必要时 37 ℃ 水浴至澄清并冷却至室温；P3 提前 2–8 ℃ 预冷。

● 将洗脱缓冲液置于 50 ℃ 水浴预热；准备宽口枪头（常规枪头剪去前端 3–5 mm）。

二、 裂解、澄清与上样调节

1. 4 ℃、6,000 × g 离心 10 min 收集 300 mL 培养菌体，彻底弃去上清。

2. 加入 16 mL P1 充分重悬至无颗粒（此步为全流程唯一允许涡旋的步骤）。

3. ★ 加入 16 mL P2，立即温和颠倒混匀 4–6 次，室温静置不超过 3 min。

4. 加入 16 mL 预冷 P3，立即温和颠倒混匀 6–8 次至形成均匀白色絮状沉淀，冰浴静置 15 min。

5. 4 ℃、12,000 × g 离心 30 min；若上清仍浑浊，经 2 层无菌纱布或折叠滤纸重力过滤。

6. ★ 加入 1.5 倍体积的 Dilution Buffer（约 72 mL），温和颠倒混匀。

三、 柱层析与回收

1. 用 50–80 mL Equilibration / Wash Buffer 平衡柱床，流速 2–4 mL/min（重力流）。

2. 将上样液沿柱壁缓慢加入，全程重力流出；建议保留流穿液以备排查。

3. 用 50–80 mL Equilibration / Wash Buffer 洗柱，去除蛋白质、多糖与松散结合杂质。

4. ★ 用 30 mL 预热至 50 ℃ 的 Elution Buffer 洗脱，每管 2 mL 分管收集，合并含 DNA 的高峰管。

5. 加入 0.7 倍体积室温异丙醇，室温静置 10 min 后立即 4 ℃、≥ 12,000 × g 离心 30 min（请勿 –20 ℃ 沉淀）。

6. 加 16 mL 室温 70 % 乙醇洗涤后离心 10 min，室温风干 5–10 min（切勿过度干燥），加 400–1000 μL TE 或无核酸酶水，4 ℃ 静置过夜复溶。