枯草芽孢杆菌感受态细胞
产品规格（CAT#: BsE1035）
WB800 Competent Cell 100μl/支 保存：-80℃（6个月）
pP43NMK (control vector, 10ng/μl) 10μl 保存：-80℃（6个月）
产品名称
产品货号
产品规格
产品配套
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电转WB800 感受态细胞
BsE1035S
5×100μl
pP43NMK (control vector, 10 ng/μl) 10μl×1支
BsE1035M
20×100μl
pP43NMK (control vector, 10 ng/μl) 10μl×1支
基因型
trpC2 nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsr Δvpr wprA::hyg
产品说明
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含脂多糖（LPS），表达的蛋白无需额外去除内毒素，适合医药或食品级应用；天然具有高效的分泌系统，可将目标蛋白直接分泌到培养基中，简化纯化步骤；多数情况下无包涵体问题，表达的可溶性蛋白正确折叠，尤其适合含二硫键的蛋白（胞外环境有助于氧化折叠）；培养简单，生长快，普通LB培养基、37℃振荡即可快速生长，发酵工艺成熟。WB800菌株是常用的多重蛋白酶缺陷株，是WB600的衍生菌株，比WB600多敲除两个蛋白酶，共有8个主要蛋白酶基因被突变，其胞外蛋白酶活性仅剩野生型的0.06%，能有效减少外源蛋白被降解，提高外源蛋白产量和稳定性。WB800的trpC 基因发生 3 bp 缺失突变，突变后菌株无法自身合成色氨酸（由于编码区缺失了3个碱基ATT，trpC基因编码的蛋白质在第110和111位氨基酸位置，由原来的两个异亮氨酸减少为一个异亮氨酸）。WB800基因组中整合了一个博来霉素抗性基因，一个杀稻瘟素抗性基因，一个潮霉素抗性基因，有博来霉素、杀稻瘟素、潮霉素抗性，同时WB800将WB800基因组中有氯霉素抗性基因，不可转化氯霉素抗性质粒。 唯地生物开发的WB800电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化，经特殊工艺制作，pP43NMK质粒（7683bp）检测转化效率>2×104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量2YT放37度预热1小时（每管感受态准备1ml 2YT）。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的WB800 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA，用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)轻轻吹吸两次混匀，将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.1 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，快速加入1ml预热的2YT，用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到1.5 ml离心管，37℃，150 rpm复苏3小时。
6. 可直接取100-200ul复苏菌液涂板，也可先离心后涂板：5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取50-100 μl涂布到含相应抗生素的2YT平板上（因菌量较大，若全部涂板请涂两块直径9cm平板）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养15-17小时。
抗生素使用浓度
1. WB800具有氯霉素抗性，不适合转化氯霉素抗性的枯草芽孢杆菌质粒。
2. 卡那抗性的枯草芽孢杆菌表达质粒（PMA5、pP43NMK【唯地货号：PB1101、PB1121】等）使用硫酸卡那霉素进行筛选，WB800使用的筛选浓度是15ug/ml(卡那霉素溶液唯地货号：YC9020L)。
3. 不同枯草菌株对抗生素的敏感度不同，不同质粒表达抗性基因的强度有差异，若使用新的质粒转化枯草菌株，所用的抗生素浓度需要做梯度试验确定。
2YT 液体培养基（货号: CM1016L）; 2YT 固体培养基（货号: CM1016S）。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA，长时间存放会降低转化效率。
2. 加入枯草孵育培养基2YT后，孵育时间可调，一般孵育时间越长，转化效率越高。
3. 枯草芽孢杆菌表达系统可用ITPG诱导型质粒或木糖诱导型质粒，当用IPTG诱导时，尽量使用不含乳糖的原料，若原料（蛋白胨，酵母粉等）中含有乳糖，会有严重的泄露表达（泄露表达是指不加诱导剂时目标蛋白的背景表达，大部分时候不影响试验）。
产品名称
产品货号
产品规格
产品配套
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电转WB800 感受态细胞
BsE1035S
5×100μl
pP43NMK (control vector, 10 ng/μl) 10μl×1支
BsE1035M
20×100μl
pP43NMK (control vector, 10 ng/μl) 10μl×1支
基因型
trpC2 nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsr Δvpr wprA::hyg
产品说明
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含脂多糖（LPS），表达的蛋白无需额外去除内毒素，适合医药或食品级应用；天然具有高效的分泌系统，可将目标蛋白直接分泌到培养基中，简化纯化步骤；多数情况下无包涵体问题，表达的可溶性蛋白正确折叠，尤其适合含二硫键的蛋白（胞外环境有助于氧化折叠）；培养简单，生长快，普通LB培养基、37℃振荡即可快速生长，发酵工艺成熟。WB800菌株是常用的多重蛋白酶缺陷株，是WB600的衍生菌株，比WB600多敲除两个蛋白酶，共有8个主要蛋白酶基因被突变，其胞外蛋白酶活性仅剩野生型的0.06%，能有效减少外源蛋白被降解，提高外源蛋白产量和稳定性。WB800的trpC 基因发生 3 bp 缺失突变，突变后菌株无法自身合成色氨酸（由于编码区缺失了3个碱基ATT，trpC基因编码的蛋白质在第110和111位氨基酸位置，由原来的两个异亮氨酸减少为一个异亮氨酸）。WB800基因组中整合了一个博来霉素抗性基因，一个杀稻瘟素抗性基因，一个潮霉素抗性基因，有博来霉素、杀稻瘟素、潮霉素抗性，同时WB800将WB800基因组中有氯霉素抗性基因，不可转化氯霉素抗性质粒。 唯地生物开发的WB800电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化，经特殊工艺制作，pP43NMK质粒（7683bp）检测转化效率>2×104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量2YT放37度预热1小时（每管感受态准备1ml 2YT）。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的WB800 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA，用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)轻轻吹吸两次混匀，将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.1 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，快速加入1ml预热的2YT，用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到1.5 ml离心管，37℃，150 rpm复苏3小时。
6. 可直接取100-200ul复苏菌液涂板，也可先离心后涂板：5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取50-100 μl涂布到含相应抗生素的2YT平板上（因菌量较大，若全部涂板请涂两块直径9cm平板）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养15-17小时。
抗生素使用浓度
1. WB800具有氯霉素抗性，不适合转化氯霉素抗性的枯草芽孢杆菌质粒。
2. 卡那抗性的枯草芽孢杆菌表达质粒（PMA5、pP43NMK【唯地货号：PB1101、PB1121】等）使用硫酸卡那霉素进行筛选，WB800使用的筛选浓度是15ug/ml(卡那霉素溶液唯地货号：YC9020L)。
3. 不同枯草菌株对抗生素的敏感度不同，不同质粒表达抗性基因的强度有差异，若使用新的质粒转化枯草菌株，所用的抗生素浓度需要做梯度试验确定。
2YT 液体培养基（货号: CM1016L）; 2YT 固体培养基（货号: CM1016S）。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA，长时间存放会降低转化效率。
2. 加入枯草孵育培养基2YT后，孵育时间可调，一般孵育时间越长，转化效率越高。
3. 枯草芽孢杆菌表达系统可用ITPG诱导型质粒或木糖诱导型质粒，当用IPTG诱导时，尽量使用不含乳糖的原料，若原料（蛋白胨，酵母粉等）中含有乳糖，会有严重的泄露表达（泄露表达是指不加诱导剂时目标蛋白的背景表达，大部分时候不影响试验）。
