克隆感受态细胞
产品规格（CAT#: DE3043）
E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) : 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
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电转E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) 感受态细胞 |
DE3043S |
5×50ul |
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| DE3043M | 20×50ul |
基因型
E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) O6:K5:H1 EndA+ Dcm+ ∆pMUT1 ∆pMUT2
产品说明
E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。大肠杆菌菌株Nissle 1917是一种非致病的共生大肠杆菌分离物，1917年由德国微生物学家Alfred Nissle 从一名未感染痢疾的士兵肠道中分离出一株大肠杆菌，这个菌株可以作为药物治疗其他感染者，后来被命名为Nissle 1917，通常也缩写为EcN。EcN是一株未经过改造的野生型大肠杆菌菌株，不产生任何肠毒素或细胞毒素（肠毒素是由某些微生物产生的毒素，可引起胃肠道症状）。EcN 属血清O6:K5:H1型，其LPS侧链较短，且K5型夹膜具有血清敏感性，在体内易被血清清除，因此EcN不具致病性。EcN可以抑制肠道内病原菌的生长，防止病原菌在肠道内定植，同时具有抗炎作用。EcN在临床上主要用于胃肠功能障碍性疾病的治疗，例如克罗恩病、炎症性肠病及便秘等。本公司的Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 菌株是不含两个野生型辅助质粒pMUT1、pMUT2的菌株，这两个质粒无已知功能，无明显的筛选标记，但在大肠杆菌中可稳定存在，可作为EcN菌株的鉴定标准质粒使用，唯地生物利用毒性基因替代法将这两个质粒敲除，获得Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 菌株，去除pMut1和pMut2可以减轻细胞的代谢负担，提高外源蛋白表达量，常用作动物体内试验(激活T细胞、肿瘤治疗、靶向释放蛋白、抗动脉粥样硬化等试验)。EcN菌株核酸酶endA1为野生型，体内核酸酶含量较高，提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液尽量去除核酸酶对质粒的污染，防止质粒降解；另外染色体中携带有功能的Dcm甲基化酶；不可用于蓝、白斑筛选。 E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2)感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>0.4×1010 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量SOC放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml SOC）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的 E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的SOC（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
7. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中37度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOB的2倍）
无质粒Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 的优点
1. 遗传稳定性和操作简便性：消除内源质粒不兼容风险，pMut1和pMut2有自己的复制子。当引入新的外源质粒时，可能会发生复制子不兼容，导致外源质粒无法稳定维持或被“排挤”掉。无质粒菌株完全消除了这一风险，极大地提高了外源质粒的转化效率和稳定性。
2. 减少基因工具间的相互干扰：pMut1和pMut2上携带的基因（如编码细菌素、调控蛋白等）可能会与引入的基因发生不可预测的交叉干扰。例如，它们可能表达某些调控蛋白，影响外源启动子的活性。无质粒菌株提供了一个“干净”的遗传背景。
3. 减少代谢负担，优化细胞性能：维持和复制质粒需要消耗宿主细胞的能量和资源。去除pMut1和pMut2可以减轻细胞的代谢负担，提高外源蛋白表达量，这对于治疗性蛋白至关重要，通常能带来更高的生长速率和蛋白产量。
4. 增强生物安全性和环境可控性：防止基因水平转移，pMut1和pMut2有可能转移到环境中的其他细菌（包括肠道内的益生菌、病原菌等）中。无质粒菌株从根本上切断了基因转移的途径，生物安全性更高。
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10；电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
2. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
3. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
4. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
5. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
6. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可减少最终用于涂板的菌量；感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率下降。
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基因型
E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) O6:K5:H1 EndA+ Dcm+ ∆pMUT1 ∆pMUT2
产品说明
E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) 电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。大肠杆菌菌株Nissle 1917是一种非致病的共生大肠杆菌分离物，1917年由德国微生物学家Alfred Nissle 从一名未感染痢疾的士兵肠道中分离出一株大肠杆菌，这个菌株可以作为药物治疗其他感染者，后来被命名为Nissle 1917，通常也缩写为EcN。EcN是一株未经过改造的野生型大肠杆菌菌株，不产生任何肠毒素或细胞毒素（肠毒素是由某些微生物产生的毒素，可引起胃肠道症状）。EcN 属血清O6:K5:H1型，其LPS侧链较短，且K5型夹膜具有血清敏感性，在体内易被血清清除，因此EcN不具致病性。EcN可以抑制肠道内病原菌的生长，防止病原菌在肠道内定植，同时具有抗炎作用。EcN在临床上主要用于胃肠功能障碍性疾病的治疗，例如克罗恩病、炎症性肠病及便秘等。本公司的Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 菌株是不含两个野生型辅助质粒pMUT1、pMUT2的菌株，这两个质粒无已知功能，无明显的筛选标记，但在大肠杆菌中可稳定存在，可作为EcN菌株的鉴定标准质粒使用，唯地生物利用毒性基因替代法将这两个质粒敲除，获得Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 菌株，去除pMut1和pMut2可以减轻细胞的代谢负担，提高外源蛋白表达量，常用作动物体内试验(激活T细胞、肿瘤治疗、靶向释放蛋白、抗动脉粥样硬化等试验)。EcN菌株核酸酶endA1为野生型，体内核酸酶含量较高，提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液尽量去除核酸酶对质粒的污染，防止质粒降解；另外染色体中携带有功能的Dcm甲基化酶；不可用于蓝、白斑筛选。 E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2)感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>0.4×1010 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量SOC放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml SOC）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的 E.coli nissle 1917 (∆pMUT1∆pMUT2) 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的SOC（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。
7. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中37度摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOB的2倍）
无质粒Ecn 1917(∆pMUT1/∆pMUT2) 的优点
1. 遗传稳定性和操作简便性：消除内源质粒不兼容风险，pMut1和pMut2有自己的复制子。当引入新的外源质粒时，可能会发生复制子不兼容，导致外源质粒无法稳定维持或被“排挤”掉。无质粒菌株完全消除了这一风险，极大地提高了外源质粒的转化效率和稳定性。
2. 减少基因工具间的相互干扰：pMut1和pMut2上携带的基因（如编码细菌素、调控蛋白等）可能会与引入的基因发生不可预测的交叉干扰。例如，它们可能表达某些调控蛋白，影响外源启动子的活性。无质粒菌株提供了一个“干净”的遗传背景。
3. 减少代谢负担，优化细胞性能：维持和复制质粒需要消耗宿主细胞的能量和资源。去除pMut1和pMut2可以减轻细胞的代谢负担，提高外源蛋白表达量，这对于治疗性蛋白至关重要，通常能带来更高的生长速率和蛋白产量。
4. 增强生物安全性和环境可控性：防止基因水平转移，pMut1和pMut2有可能转移到环境中的其他细菌（包括肠道内的益生菌、病原菌等）中。无质粒菌株从根本上切断了基因转移的途径，生物安全性更高。
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10；电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
2. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
3. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
4. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
5. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
6. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可减少最终用于涂板的菌量；感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率下降。
