酿酒酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: YC1101）
△fet3△fet4 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pYES2 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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△fet3△fet4 感受态细胞 |
YC1101S |
10×100ul |
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| YC1101M | 50×100ul |
基因型
MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52 △fet3 △fet4
产品说明
△fet3△fet4菌株来源于BY4741，为配子MATa型，主要应用于二价铁离子转运蛋白的研究。Fet3p蛋白是多铜亚铁氧化酶，为单次跨膜蛋白，负责高亲和铁摄取通路；Fet4p蛋白是二价金属通透转运蛋白，为多次跨膜蛋白，负责低亲和铁摄取通路。FET3、FET4主要定位于细胞质膜，∆fet3∆fet4同时敲除高亲和通路关键酶 FET3，低亲和主转运蛋白 FET4，酵母两条主流质膜铁摄取通路完全失活，仅存微弱辅助铁吸收，是经典铁摄取完全缺陷模式菌株，是发现和研究铁离子转运蛋白的高效试验平台。△fet3△fet4突变体中FET3、FET4两个基因的编码区均被删除，转运二价铁离子的能力降低，双敲后，细胞游离 Fe2+/ 游离 Fe3+（需先还原为 Fe2+）几乎无法从胞外吸收，仅剩余铁载体螯合 Fe3+（Arn 家族）一条次要通路，其表型：无铁或低铁培养基严重生长缺陷，几乎不长、菌落极小、生长极慢；野生型正常生长。△fet3△fet4酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2、pDR195、pDR196等质粒转化进入△fet3△fet4细胞内，筛选标志为URA，可用SD-URA平板进行筛选。唯地生物生产的△fet3△fet4感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的△fet3△fet4感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
亚铁离子转运试验示例/唯地生物验证试验
空载体pDR196为阴性对照； pDR196-OsNramp5(表达水稻Nramp5基因)为阳性对照；这两个质粒分别转化△fet3△fet4 酵母细胞，点板做表型分析。结果如下图所示：△fet3△fet4(含pDR196)菌株在SD-U-Fe（含10μM Fe-EDTA）基础培养基中正常生长，在SD-U（含20 μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）的培养基中不生长；△fet3△fet4(含pDR196-OsNramp5)菌株在SD-U-Fe（含10μM Fe-EDTA）的培养基中正常生长，在SD-U（含20 μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）基础培养基中生长受抑制（但能长出菌落），且菌落呈现粉紫色；说明OsNramp5基因具有转运铁离子的功能。
补充说明：
1. BPDS（4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate）仅与Fe2+特异性结合，不能螯合三价铁离子；
2. 酵母的不同菌落中目的蛋白的表达会表现出不同表达量的差异，所以不同△fet3△fet4(含pDR196-OsNramp5)菌落在SD-U（含20μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）基础培养基中的表型有差异。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
2. 酵母为真核生物，不易长期保存，建议保存时间不超过90天。
3. △fet3△fet4酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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△fet3△fet4 感受态细胞 |
YC1101S |
10×100ul |
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| YC1101M | 50×100ul |
基因型
MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52 △fet3 △fet4
产品说明
△fet3△fet4菌株来源于BY4741，为配子MATa型，主要应用于二价铁离子转运蛋白的研究。Fet3p蛋白是多铜亚铁氧化酶，为单次跨膜蛋白，负责高亲和铁摄取通路；Fet4p蛋白是二价金属通透转运蛋白，为多次跨膜蛋白，负责低亲和铁摄取通路。FET3、FET4主要定位于细胞质膜，∆fet3∆fet4同时敲除高亲和通路关键酶 FET3，低亲和主转运蛋白 FET4，酵母两条主流质膜铁摄取通路完全失活，仅存微弱辅助铁吸收，是经典铁摄取完全缺陷模式菌株，是发现和研究铁离子转运蛋白的高效试验平台。△fet3△fet4突变体中FET3、FET4两个基因的编码区均被删除，转运二价铁离子的能力降低，双敲后，细胞游离 Fe2+/ 游离 Fe3+（需先还原为 Fe2+）几乎无法从胞外吸收，仅剩余铁载体螯合 Fe3+（Arn 家族）一条次要通路，其表型：无铁或低铁培养基严重生长缺陷，几乎不长、菌落极小、生长极慢；野生型正常生长。△fet3△fet4酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2、pDR195、pDR196等质粒转化进入△fet3△fet4细胞内，筛选标志为URA，可用SD-URA平板进行筛选。唯地生物生产的△fet3△fet4感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，AmpR）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的△fet3△fet4感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。
亚铁离子转运试验示例/唯地生物验证试验
空载体pDR196为阴性对照； pDR196-OsNramp5(表达水稻Nramp5基因)为阳性对照；这两个质粒分别转化△fet3△fet4 酵母细胞，点板做表型分析。结果如下图所示：△fet3△fet4(含pDR196)菌株在SD-U-Fe（含10μM Fe-EDTA）基础培养基中正常生长，在SD-U（含20 μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）的培养基中不生长；△fet3△fet4(含pDR196-OsNramp5)菌株在SD-U-Fe（含10μM Fe-EDTA）的培养基中正常生长，在SD-U（含20 μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）基础培养基中生长受抑制（但能长出菌落），且菌落呈现粉紫色；说明OsNramp5基因具有转运铁离子的功能。
补充说明：
1. BPDS（4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate）仅与Fe2+特异性结合，不能螯合三价铁离子；
2. 酵母的不同菌落中目的蛋白的表达会表现出不同表达量的差异，所以不同△fet3△fet4(含pDR196-OsNramp5)菌落在SD-U（含20μM BPDS+100 μM L-抗坏血酸）基础培养基中的表型有差异。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
2. 酵母为真核生物，不易长期保存，建议保存时间不超过90天。
3. △fet3△fet4酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
