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HB101(含pRK2013) 二代甘油菌种	Beh1011	400ul/1支

产品说明

pRK2013 是通过重组DNA技术构建的合成质粒，来源于 pRK2 质粒，pRK2 提供全套高效接合转移所需的基因（tra 和 trb 等）。为了使该质粒能在常规大肠杆菌中方便操作，研究人员将来源于 ColE1 质粒的复制起始位点（ColE1 ori）和一段包含卡那霉素抗性基因（kanR）的 Tn903 转座子插入到 pRK2 骨架中，保留了完整的 RK2 质粒接合转移基因，能有效驱动其他质粒的转移。自1980年构建以来，在超过 2000 篇文献中使用。其宿主范围广泛，能将质粒转移至不动杆菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属等多种革兰氏阴性菌，甚至部分革兰氏阳性菌中。

pRK2013工作原理：三亲本接合法 (Triparental Mating)

这是 pRK2013 最核心的应用场景。其工作原理涉及三种不同的细菌：

供体菌 (Donor)：含有待转移的目标质粒（该质粒需带有 oriT 转移起始点）的大肠杆菌。

辅助菌 (Helper)：含有 pRK2013 质粒的大肠杆菌。

受体菌 (Recipient)：最终接收目标质粒的目的菌，如根癌农杆菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等。

作用机制：将三种细菌混合培养时，pRK2013 利用其编码的接合蛋白（Mob/Tra 蛋白），游动进入供体菌。在供体菌内，pRK2013 识别目标质粒上的 oriT 序列，并动员目标质粒进入受体菌。pRK2013 本身通常不会进入最终受体菌，从而避免了外源遗传元件的持续干扰（部分实验中，pRK2013 可以进入受体菌，但不能在许多非肠道革兰氏阴性菌中复制）。

核心用途：非自转移质粒的动员 (Mobilization of Non-self-transmissible Plasmids)，作为最经典的帮助质粒（Helper Plasmid），pRK2013 的核心作用是辅助那些自身缺乏移动能力的质粒进行接合转移。在植物遗传转化、难转化芽孢杆菌或假单胞菌的质粒转化等实验中，它能通过三亲接合的方式，将目标质粒从大肠杆菌转移到根癌农杆菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等受体菌中。

附言：待转移的目标质粒必须带有一个特定的转移起始点（oriT），pRK2013 的游动和转移基因才能对其起作用，并驱动其转移进入受体菌；若质粒同时含有活化位点（bom），可促进质粒移动，部分受体菌不需要质粒含有bom序列。

操作方法

1，客户收到菌株后，不可直接吸取菌液接种扩繁。应先对菌种进行复壮，待长出单菌落后挑单菌落接菌扩繁；复壮方法如下：在超净台打开盖子，用接种环沾取少量甘油菌液采用交叉划线法（图1）在LB+Kan50ug/ml平板表面轻轻划线(注意：不要刺破培养基)，将平板封口后放37度培养15-20h，即可长出单菌落。

2，交叉划线法：划线的目的是经过几次不连续划线达到梯度稀释菌液的效果，保证能长出单菌落。具体步骤如下：

A，-80度取出的甘油菌应在超净台打开盖子，立即在表面挑取菌液/菌块划线，不用等融化后划线，固体状态时即可用接种环挑取划线，操作要点是“快速操作，立即划线”，目的是最大限度减少温度波动对菌种造成的“冷休克”和冰晶物理损伤；如果收到的是液体甘油菌，可直接划线，在超净台打开盖子用接种环沾取少量甘油菌液划线。

B，取出无菌接种环，注意不要污染，图1所示为标准的五段交叉划线法，分五个区，每个区划三条直线，第1、2区可共用一个接种环，划好1，2区后换一个新接种环划第3区，再换一个新接种环划第4区，再换一个新接种环划第5区，每一次换接种环划线要经过前面划线区的划线痕迹，这样就相当于对菌种进行稀释。简易划线也可只划3个区或4个区。          

C，客户也可用金属接种环灼烧后划线；本公司提供的接种环为ABS材质，不可灼烧。  

图1. 五段交叉划线法示意图

注意事项

1，客户收到二代甘油菌株后，应立即放-80度保存，不可放-20度保存。

2，应减少甘油菌冻融的次数，冻融的次数越多，菌种的活力越低；

3，若扩繁菌种，注意一次扩繁不要超过四个世代，以保证菌种基因组的稳定；扩增后重新保存的菌种必须对菌种做表型、功能验证，所有表型、功能保持完好的菌株才能作为菌种使用。

相关文献

Hall, A., Donohue, T. J., & Peters, J. M. (2023). Complete sequences of conjugal helper plasmids pRK2013 and pEVS104. microPublication Biology, 2023. Available at: https://www.osti.gov/biblio/2202406.

Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., & Helinski, D. R. (1980). Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proceedings of the National Academy of Sciences, 77(12), 7347-7351.Figurski, D. H., & Helinski, D. R. (1979). Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(4), 1648-1652.