克隆感受态细胞
产品规格（CAT#: DL1071B）
DH10Bac (BmNPV) Competent Cell 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl) 10μl
保存条件(保质期) -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞 |
DL1071BS |
10×100ul |
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| DL1071BM | 50×100ul |
基因型
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG / bMON14272-Bm / pMON7124
产品说明
DH10Bac (BmNPV) 菌株与DH10Bac菌株的主要区别是细胞内的父本杆粒不同，两个菌株的核基因及辅助质粒完全一样。DH10Bac，即是DH10Bac (AcMNPV)，内含父本杆粒：bMON14272（来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 AcMNPV），配套的昆虫细胞为Sf9、Sf21、High 5等草地夜蛾 / 粉纹夜蛾细胞；DH10Bac (BmNPV)，内含父本杆粒：bMON14272-Bm（来源于家蚕核型多角体病毒 BmNPV），配套的昆虫细胞为 BmN、Bm5 等家蚕细胞，AcMNPV病毒不能感染家蚕细胞，BmNPV病毒也不能感染夜蛾细胞。两种父本杆粒在不同的昆虫细胞中表达目标蛋白，不同的昆虫细胞具有不同的蛋白表达谱和表达偏好，所以两种昆虫系统功能具有互补性，不能相互代替。DH10Bac (BmNPV)主要用于生产Bm重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272-Bm 、辅助质粒 pMON7124 ：父本杆粒 bMON14272-Bm包含 mini-F复制子，卡那抗性基因，完整野生型 BmMNPV 病毒基因组（昆虫细胞复制、包装病毒衣壳骨架等必需基因），晚期 / 极晚期强启动子蛋白表达框（外源蛋白表达框），attTn7 位点和 lacZα互补因子；辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区，编码转移酶和四环素抗性基因，主要作用是促进Tn7转移，提高供体pFastBac系列质粒（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac (BmNPV) 菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac (BmNPV) ）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac (BmNPV) 可用于蓝白斑筛选，DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108cfu/μg DNA。
附言：配套DH10Bac (AcMNPV)系统的pFastBac、pFastBac-HTA/B/C、pFastBac-Dual等质粒同样适配DH10Bac (BmNPV) 系统。操作方法与DH10Bac (AcMNPV)系统完全一致。
操作方法
供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：
1. DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225 rpm复苏4小时。
4. 复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），吸取每个稀释梯度复苏液100μl铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline，40μg/ml X-gal，40μg/ml IPTG。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到成功重组的菌落）。
阳性验证：
1. 挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline，40μg/ml X-gal，40μg/ml IPTG）。37度过夜培养。
2. 挑选白色的克隆，转接到含有50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline的LB培养液中，过夜培养。
3. 使用质粒中提或大提试剂盒或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（病毒杆粒＞100kb，质粒小提试剂盒提取质粒浓度过低，杂质含量高，不适合后续的昆虫细胞转染试验）。
4. 使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。
pUC19检测转化效率方法：
1. DH10Bac (BmNPV) 感受细胞态从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB，37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 取100μl转化液涂布到含50-100μg/ml氨苄的LB平板上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h，统计计算转化效率。
配套试剂货号
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产品名称 |
货号 |
产品名称 |
货号 |
产品名称 |
货号 |
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pFastBac-HTC 质粒 |
CAT#:PA1006 |
pFastBac1 |
CAT#:PA1007 |
pFastBac-HTA |
CAT#:PA1008 |
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pFastBac-Dual |
CAT#:PA1009 |
LB 固体培养基 |
CAT#:CM1010S |
硫酸卡那霉素 |
CAT#:YC9020L |
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氨苄青霉素钠 |
CAT#:YC9020L |
庆大霉素 |
CAT#:YC9090L |
四环素 |
CAT#:YC9050L |
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X-Gal 溶液（20 mg/ml，过滤除菌） |
CAT#:YC8012 |
IPTG 溶液（100 mg/ml） |
CAT#:YC8024 |
Sf9/Sf21细胞专用无血清培养基 |
CAT#:ISC2001 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 涂板时务必涂干，平板表面不留任何水份。
4. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2倍）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞 |
DL1071BS |
10×100ul |
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| DL1071BM | 50×100ul |
基因型
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG / bMON14272-Bm / pMON7124
产品说明
DH10Bac (BmNPV) 菌株与DH10Bac菌株的主要区别是细胞内的父本杆粒不同，两个菌株的核基因及辅助质粒完全一样。DH10Bac，即是DH10Bac (AcMNPV)，内含父本杆粒：bMON14272（来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 AcMNPV），配套的昆虫细胞为Sf9、Sf21、High 5等草地夜蛾 / 粉纹夜蛾细胞；DH10Bac (BmNPV)，内含父本杆粒：bMON14272-Bm（来源于家蚕核型多角体病毒 BmNPV），配套的昆虫细胞为 BmN、Bm5 等家蚕细胞，AcMNPV病毒不能感染家蚕细胞，BmNPV病毒也不能感染夜蛾细胞。两种父本杆粒在不同的昆虫细胞中表达目标蛋白，不同的昆虫细胞具有不同的蛋白表达谱和表达偏好，所以两种昆虫系统功能具有互补性，不能相互代替。DH10Bac (BmNPV)主要用于生产Bm重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272-Bm 、辅助质粒 pMON7124 ：父本杆粒 bMON14272-Bm包含 mini-F复制子，卡那抗性基因，完整野生型 BmMNPV 病毒基因组（昆虫细胞复制、包装病毒衣壳骨架等必需基因），晚期 / 极晚期强启动子蛋白表达框（外源蛋白表达框），attTn7 位点和 lacZα互补因子；辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区，编码转移酶和四环素抗性基因，主要作用是促进Tn7转移，提高供体pFastBac系列质粒（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac (BmNPV) 菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac (BmNPV) ）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac (BmNPV) 可用于蓝白斑筛选，DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108cfu/μg DNA。
附言：配套DH10Bac (AcMNPV)系统的pFastBac、pFastBac-HTA/B/C、pFastBac-Dual等质粒同样适配DH10Bac (BmNPV) 系统。操作方法与DH10Bac (AcMNPV)系统完全一致。
操作方法
供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：
1. DH10Bac (BmNPV) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225 rpm复苏4小时。
4. 复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），吸取每个稀释梯度复苏液100μl铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline，40μg/ml X-gal，40μg/ml IPTG。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到成功重组的菌落）。
阳性验证：
1. 挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline，40μg/ml X-gal，40μg/ml IPTG）。37度过夜培养。
2. 挑选白色的克隆，转接到含有50μg/ml Kan，7μg/ml Gentamicin，7μg/ml tetracycline的LB培养液中，过夜培养。
3. 使用质粒中提或大提试剂盒或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（病毒杆粒＞100kb，质粒小提试剂盒提取质粒浓度过低，杂质含量高，不适合后续的昆虫细胞转染试验）。
4. 使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。
pUC19检测转化效率方法：
1. DH10Bac (BmNPV) 感受细胞态从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB，37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 取100μl转化液涂布到含50-100μg/ml氨苄的LB平板上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h，统计计算转化效率。
配套试剂货号
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产品名称 |
货号 |
产品名称 |
货号 |
产品名称 |
货号 |
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pFastBac-HTC 质粒 |
CAT#:PA1006 |
pFastBac1 |
CAT#:PA1007 |
pFastBac-HTA |
CAT#:PA1008 |
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pFastBac-Dual |
CAT#:PA1009 |
LB 固体培养基 |
CAT#:CM1010S |
硫酸卡那霉素 |
CAT#:YC9020L |
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氨苄青霉素钠 |
CAT#:YC9020L |
庆大霉素 |
CAT#:YC9090L |
四环素 |
CAT#:YC9050L |
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X-Gal 溶液（20 mg/ml，过滤除菌） |
CAT#:YC8012 |
IPTG 溶液（100 mg/ml） |
CAT#:YC8024 |
Sf9/Sf21细胞专用无血清培养基 |
CAT#:ISC2001 |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 涂板时务必涂干，平板表面不留任何水份。
4. 若要获得大量，高纯度质粒，建议在TB培养基（唯地CAT#：CM1018L）中摇菌培养（以标准质粒PUC19为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度和质粒产量为LB的3-4倍，SOC的2倍）
