共表达分子伴侣表达感受态细胞
产品规格 （CAT#: ECC0107）
BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG： 100μl/支 保存： -80℃（6个月）
pUC19 (control vector, 10pg/μl) 10μl 保存：-80℃（36个月）
分子伴侣诱导剂I（100×） 5ml/15ml 保存：4℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG 感受态细胞 |
ECC0107S |
10×100μl |
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| ECC0107M | 50×100μl |
基因型
F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3) [DnaK DnaJ GrpE EL ES TIG CamR]
产品说明
BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG，是含有DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG六种分子伴侣的BL21(DE3)。DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG是来自大肠杆菌的伴侣蛋白，在18-37℃表现出较高活性，在BL21(DE3)细胞中表达时，可辅助外源蛋白折叠，形成正确构象，减少重组蛋白包涵体的形成，增加可溶重组蛋白的表达量及生物活性。BL21(DE3))-KJE- EL-ES菌株基因组中整合了λ噬菌体DE3区（含有T7噬菌体RNA聚合酶）可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG菌株具有氯霉素抗性，感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×107 cfu/µg DNA。
操作方法
1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
抗生素使用方法
BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG感受态含有具有氯霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20ug/ml的氯霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导。
抗生素使用浓度
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抗生素名称 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素 (carb) (唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素 (kan) (唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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氯霉素 (Cam) (唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素 (Gent) (唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
共表达分子伴侣，诱导目标蛋白操作步骤
一．BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），同时在LB营养液中加入终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，37℃，200rpm
摇菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG分子伴侣来自大肠杆菌，在18-37度时活性更高，温度越高活性越高，最适温度为25-37度。
二．自诱导培养基诱导目标蛋白方法：
1. 小摇：参考以上菌株对应抗生素添加抗生素，37℃，200 rpm过夜摇菌约10-24h，菌体摇浓，一般要求OD600>2.0。
2. 按2-5%的比例接菌到AIM-2YT Broth自诱导培养基中，添加终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，
A. 30-37度诱导：200-300rpm，摇菌8-24h。
B. 18-25度诱导：200-300rpm，摇菌12-48h。
C. 若所表达蛋白为毒性蛋白，可先在37度摇菌，待菌体OD600=0.8左右时降温到目标温度开始诱导蛋白表达。
3. 最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样。
分子伴侣的大小及检测
1. DnaK：70 kDa左右，DnaJ：40 kDa左右，GrpE：20 kDa，EL：60 kDa，ES：10 kDa左右，TIG：60 kDa。
2. 在SDS-PAGE凝胶电泳时，大部分情况可以看到共表达的分子伴侣条带，但10 kDa，20kDa条带并不清晰；若表达的目标蛋白影响了大肠杆菌的细胞周期和表达谱，有些分子伴侣表达量会下降，可能看不到相应的分子伴侣条带或条带较弱。
相关产品货号
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IPTG 溶液（1M，过滤除菌），货号：YC8022 |
LB 固体，货号：CM1010S |
LB 液体，货号：CM1010L |
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高密度LB 液体培养基，货号：CM1310L |
2YT 液体，货号：CM1016L |
TB 液体，货号：CM1018L |
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AIM-LB 自诱导培养基，货号：AIM1014L |
AIM-2YT 自诱导培养基，货号：AIM1016L |
ZYM-5052液体，货号：AIM1031L |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 诱导时，IPTG浓度可在0.1-20 mM之间优化，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
3. 分子伴侣诱导剂I（100×）在4℃可稳定保存12个月；放-20℃可稳定保存24个月。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG 感受态细胞 |
ECC0107S |
10×100μl |
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| ECC0107M | 50×100μl |
基因型
F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3) [DnaK DnaJ GrpE EL ES TIG CamR]
产品说明
BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG，是含有DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG六种分子伴侣的BL21(DE3)。DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG是来自大肠杆菌的伴侣蛋白，在18-37℃表现出较高活性，在BL21(DE3)细胞中表达时，可辅助外源蛋白折叠，形成正确构象，减少重组蛋白包涵体的形成，增加可溶重组蛋白的表达量及生物活性。BL21(DE3))-KJE- EL-ES菌株基因组中整合了λ噬菌体DE3区（含有T7噬菌体RNA聚合酶）可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG菌株具有氯霉素抗性，感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×107 cfu/µg DNA。
操作方法
1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
抗生素使用方法
BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG感受态含有具有氯霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20ug/ml的氯霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导。
抗生素使用浓度
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抗生素名称 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素 (carb) (唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素 (kan) (唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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氯霉素 (Cam) (唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素 (Gent) (唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
共表达分子伴侣，诱导目标蛋白操作步骤
一．BL21(DE3)-KJE-EL-ES-TIG感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），同时在LB营养液中加入终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，37℃，200rpm
摇菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG分子伴侣来自大肠杆菌，在18-37度时活性更高，温度越高活性越高，最适温度为25-37度。
二．自诱导培养基诱导目标蛋白方法：
1. 小摇：参考以上菌株对应抗生素添加抗生素，37℃，200 rpm过夜摇菌约10-24h，菌体摇浓，一般要求OD600>2.0。
2. 按2-5%的比例接菌到AIM-2YT Broth自诱导培养基中，添加终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，
A. 30-37度诱导：200-300rpm，摇菌8-24h。
B. 18-25度诱导：200-300rpm，摇菌12-48h。
C. 若所表达蛋白为毒性蛋白，可先在37度摇菌，待菌体OD600=0.8左右时降温到目标温度开始诱导蛋白表达。
3. 最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样。
分子伴侣的大小及检测
1. DnaK：70 kDa左右，DnaJ：40 kDa左右，GrpE：20 kDa，EL：60 kDa，ES：10 kDa左右，TIG：60 kDa。
2. 在SDS-PAGE凝胶电泳时，大部分情况可以看到共表达的分子伴侣条带，但10 kDa，20kDa条带并不清晰；若表达的目标蛋白影响了大肠杆菌的细胞周期和表达谱，有些分子伴侣表达量会下降，可能看不到相应的分子伴侣条带或条带较弱。
相关产品货号
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IPTG 溶液（1M，过滤除菌），货号：YC8022 |
LB 固体，货号：CM1010S |
LB 液体，货号：CM1010L |
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高密度LB 液体培养基，货号：CM1310L |
2YT 液体，货号：CM1016L |
TB 液体，货号：CM1018L |
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AIM-LB 自诱导培养基，货号：AIM1014L |
AIM-2YT 自诱导培养基，货号：AIM1016L |
ZYM-5052液体，货号：AIM1031L |
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 诱导时，IPTG浓度可在0.1-20 mM之间优化，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
3. 分子伴侣诱导剂I（100×）在4℃可稳定保存12个月；放-20℃可稳定保存24个月。
