质粒图谱与基础信息

产品说明

pTCK303-Dsred质粒是农杆菌介导的RNAi双元载体，在植物基因功能研究和遗传改良等领域应用广泛，由玉米Ubiquitin启动子（ZmUbi）驱动RNAi表达框，表达框的中间是来自水稻的一个基因内含子：Rice intron，在目标基因编码区选择一段约150-300bp的特异片段，将这个片段以正向和反向方式分别连接到Rice intron的两侧区域，这样转录出来的mRNA会在Rice intron的引导下高效组装成双链RNA分子，该双链RNA分子被细胞内的RNA干扰机制识别并切割，产生小分子干扰RNA（siRNA），进而特异性降解靶标mRNA，实现对目的基因的下调或沉默。pTCK303-Dsred质粒在大肠杆菌和农杆菌的筛选标记是KAN；同时含有HYG，mgfp5，GUS三个植物筛选标记，可在单子叶植物水稻、玉米、小麦或双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、大豆等物种中实现目标基因的下调。

1，本公司质粒均为质粒大提试剂盒提取质粒，因不同质粒的复制子不同，质粒浓度有差异，收到质粒后可直接酶切用于构建载体。

2，随质粒同时提供一管含有质粒的DH5α-m甘油菌种，收到菌种后可直接放-80度长期保存，也可用交叉划线法划线后挑单菌落接菌，大量扩繁质粒。DH5α-m菌株兼顾DH5α和DH10B菌株的优点，在DH5α基因组中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突变使得DH5α-m菌株中保存的质粒更稳定，有利于质粒大量扩繁。

3，质粒序列可在产品页面下载snapgene文件或text文件。

菌株交叉划线法

1，客户收到菌株后，不可直接吸取菌液接种扩繁。应先对菌种进行复壮，待长出单菌落后挑单菌落接菌扩繁；复壮方法如下：在超净台打开盖子，用接种环沾取少量甘油菌液采用交叉划线法（图1）在含相应抗生素的LB平板表面轻轻划线(注意：不要刺破培养基)，将平板封口后放培养箱培养15-20h，即可长出单菌落。

2，交叉划线法：划线的目的是经过几次不连续划线达到梯度稀释菌液的效果，保证能长出单菌落。具体步骤如下：

A，-80度取出的甘油菌应在超净台打开盖子，立即在表面挑取菌液/菌块划线，不用等融化后划线，固体状态时即可用接种环挑取划线，操作要点是“快速操作，立即划线”，目的是最大限度减少温度波动对菌种造成的“冷休克”和冰晶物理损伤；如果收到的是液体甘油菌，可直接划线，在超净台打开盖子用接种环沾取少量甘油菌液划线。

B，用金属接种环灼烧待冷却后划线，注意不要污染，图1所示为标准的五段交叉划线法，分五个区，每个区划三条直线，第1、2区可共用一个接种环，划好1，2区后换一个新接种环划第3区，再换一个新接种环划第4区，再换一个新接种环划第5区，每一次换接种环划线要经过前面划线区的划线痕迹，这样就相当于对菌种进行稀释。简易划线也可只划3个区或4个区。

图1. 五段交叉划线法示意图

注意事项

1，收到含有质粒的菌株应立即放-80度，不可放-20度保存；在4度或室温长时间存放会增加发生错误突变的概率。

2，质粒在不同实验室保存的过程中有发生突变的概率，所以实际的测序结果与数据库下载序列可能会有部分序列存在SNP或突变，只要不在核心元件发生突变或不影响质粒核心功能，一般不影响使用。