酿酒酵母感受态细胞
产品说明
YTK12菌株是一个蔗糖转化酶（SUC2）缺陷型酿酒酵母。酵母蔗糖转化酶（SUC2）可将蔗糖或棉子糖水解成葡萄糖和果糖；可以定位于细胞质并分泌到细胞外起作用，该基因的N端有一个外分泌信号肽，这个信号肽引导蔗糖转化酶分泌到细胞外起作用。YTK12菌株中的SUC2基因被突变，无法合成蔗糖转化酶，YTK12酵母菌株为SUC2基因缺陷型菌种，无法在以棉子糖为单一碳源的YPRAA培养基上正常生长。另外，蔗糖转化酶（SUC2）的水解产物葡萄糖可以将 2,3,5-三苯基四唑氯（TTC）还原为不溶的红色物质1,3,5-三苯基甲酸（TPF），通过显色反应也可以判断待验证多肽是否有分泌功能。YTK12菌株筛选标记(Transformation marker)为：trp1，his3，ura3。
pSUC2载体属酵母分泌信号肽功能验证系统的基础载体，核心结构在于SUC2的N端信号肽被切除，其上游设有多克隆位点，即SUC2蛋白的N端可插入待检测的信号肽序列或含信号肽的靶基因片段。若插入的序列含功能性分泌信号肽，可引导SUC2融合蛋白分泌至酵母细胞外，使酵母能在以棉子糖为唯一碳源的YPRA或YPRAA培养基上正常生长（SUC2催化蔗糖分解为可利用的单糖）。
产品规格
|
产品名称 |
产品货号 |
产品价格 |
说明书下载 |
|
YTK12酵母信号肽分泌检测试剂盒 |
YCK7170 |
3880 |
 |
产品内容
组分类别
组分名称
规格
货号
储存温度
培养基
CMD-W Broth
0.5L×1袋
YM8012L
RT
CMD-W with Agar
0.5L×1袋
YM8012S
RT
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
0.5L×1袋
YM8014S
RT/-20℃
试剂
TTC反应缓冲液
25 mL×1瓶
YC4041-25
2-8℃
试剂
10%蔗糖溶液（w/v）
50 mL×1瓶
C1061-50
2-8℃
试剂
1%TTC显色液
5 mL×1瓶
YC4042-5
避光/2-8℃
质粒
pSUC2
50 µL×1支
PS1029
-20℃
pSUC2-Avr1b
50 µL×1支
PS1028
-20℃
酵母感受态
YKT12 Chemically Competent Cell
100 µL×20支
YC1170-20
-80℃
pYES2 (control vector, 10 ng/μl)
10 µL×1支
-20℃
Carrier DNA (10 μg/μl)
100 µL×2支
-20℃
PEG/LiAC
5 mL×2支
4℃
说明书
/
1份
/
/
产品特点
本试剂盒可用于检测信号肽是否具有分泌功能，简单高效。包含了信号肽分泌检测所需的全部培养基、试剂、菌株和载体。
操作步骤
一、培养基配制
CMD-W Broth液体培养基：取CMD-W Broth培养基一袋，加蒸馏水450 mL搅拌溶解后，定容到0.5 L（不用调pH值），121℃-15 min高压灭菌，灭菌后温度降到30℃以下使用。
CMD-W with Agar固体培养基：取CMD-W with Agar培养基一袋，加蒸馏水450 mL溶解（Agar不溶），定容到0.5 L（不用调pH值），121℃-15 min灭菌，灭菌后温度降到55度以下倒平板即可。
YPRAA with Agar固体培养基：取YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)一袋，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L（不用调pH值），121℃-15 min高压灭菌，温度降到55℃以下加入20%棉子糖溶液50 mL，倒平板即为YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)平板；每100 mL YPRA培养基中加入1 mg/mL的抗霉素A溶液5 µL，倒平板即为YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)平板。
二、实验方法
1. 载体构建
将待验证基因的信号肽区域SP构建到pSUC2载体EcoRI & XhoI之间，即为实验pSUC2-SP。pSUC2载体信息参见本公司官网。
2. 酵母转化
（1）Carrier DNA的预处理：将Carrier DNA插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
（2）取100 µL冰上融化的YKT12感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30℃水浴30 min（15 min时翻转6-8次混匀）。
（3）将管放42℃水浴15 min（7.5 min时翻转6-8次混匀）。
（4）5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。
（5）ddH2O 50 µL重悬，涂CMD-W板，29℃培养48-96 h。
按表2将质粒分别转入酵母YKT12感受态细胞。
表2 酵母转化质粒
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质粒 |
培养基 |
|
pSUC2 |
CMD/-W with Agar |
|
pSUC2-Avr1b |
同上 |
|
pSUC2-SP |
同上 |
3. 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可选做，也可忽略不做，鉴定引物可使用T7：TAATACGACTCACTATAGG；ADH1 promoter-F：CGGTATACGG CCTTCCTTCC，pSUC2空载体PCR条带大小为：288 bp，pSUC2-SP需加上信号肽序列长度。
4. 信号肽分泌检测
（1）转化后，将酵母细胞铺布在CMD-W培养基板上，于30℃倒置培养48-72 h；
（2）挑选较大的阳性单菌落于CMD-W液体培养基中振荡培养过夜；
（3）取1 mL菌液，5000 rmp离心1 min，弃上清，并用灭菌ddH2O洗涤三次，调OD600为0.5，用ddH2O进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍（即OD600为0.05、0.005、0.0005、0.00005）。
（4）按照顺序分别取5 μL点板至CMD-W、YPRA以及YPRAA培养基上，30℃培养2-5 d（其中YPRAA平板需培养5-6 d），观察酵母生长状态。
【注意：YKT12感受态在CMD-W平板或其他缺色氨酸/Trp的平板上容易长出假阳性菌落，假阳性菌落偏小，应避开小菌落，挑较大的阳性单菌落，并对选中的菌落应做好标记或保种，以备下次使用；平板要事先倒好，打开盖子在超净台吹1小时后点板，每个位置点5ul，不可点样过多，菌液过多或平板不干会导致菌液不易干，相邻位置的菌液扩散后容易连成片或菌液扩散形状不规则，一般点样后2分钟内干燥为宜。】
（5）另取1.5 mL菌液，5000 rpm离心1 min，弃上清，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
（6）用750 μL无菌ddH2O重悬，加入250 μL TTC反应缓冲液，500 μL10%蔗糖溶液（w/v），在37°C下孵育10分钟。
（7）5000 rpm离心1 min，取100 μL上清液，于1.5 mL离心管中，加入900 μL 0.1%TTC溶液(用1 M NaOH稀释至0.1%)，室温孵育5分钟。如果信号肽功能正常，则会观察到溶液变红色，而携带pSUC2载体的YTK12菌株则不会观察到红色或红色很弱（室温孵育时间要做预试验确认，一般控制在20分钟以内）。
5. 示例结果分析
阳性对照YTK12（pSUC2-Avr1b）可以在YPRAA（含琼脂粉，含抗霉素A）培养基上生长，阴性对照YTK12（pSUC2）在YPRAA（含琼脂粉，含抗霉素A）平板上生长状态弱于阳性对照；阳性对照YTK12（pSUC2-Avr1b）分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成单糖，单糖与TTC反应变成红色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑。阴性对照YTK12（pSUC2）不分泌蔗糖酶，因此不能与TTC发生显色反应（图1）。如实验组pSUC2-SP与阳性对照结果一致，则表明该基因的信号肽具有分泌功能。反之，则表明该基因的信号肽不具有分泌功能。
图1 Avr1b信号肽功能验证（本公司验证结果）
6. 若没有观察到预期表型，可能原因分析如下：
（1）目标基因无相关功能；
（2）目标基因功能较弱，需要优化TTC浓度、孵育时间，或其他试验条件；
（3）目标基因无表达，或表达量弱，可western blot检测目标基因是否表达，若没有表达，需要重新优化密码子构建酵母表达质粒。
注意事项
1. 点板之前，阴性对照、阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照、阳性对照与试验组的OD值一定要调一致。
2. 稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。
3. TTC不能在水中长期保存，使用时将1%TTC用1 M NaOH稀释至0.1%使用。
4. 最后一步显色反应，加入TTC溶液，室温孵育的时间要做预试验确认，一般控制在20分钟以内。
参考文献
[1] Jacobs KA, Collins-Racie LA, Colbert M, et al. A genetic selection for isolating cDNAs encoding secreted proteins. Gene. 1997 Oct 1;198(1-2):289-96.
[2] Daolong D ,D S K ,Xia W , et al. RXLR-mediated entry of Phytophthora sojae effector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery. [J]. The Plant cell, 2008, 20 (7): 1930-47.
产品规格
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产品名称 |
产品货号 |
产品价格 |
说明书下载 |
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YTK12酵母信号肽分泌检测试剂盒 |
YCK7170 |
3880 |
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产品内容
组分类别
组分名称
规格
货号
储存温度
培养基
CMD-W Broth
0.5L×1袋
YM8012L
RT
CMD-W with Agar
0.5L×1袋
YM8012S
RT
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
0.5L×1袋
YM8014S
RT/-20℃
试剂
TTC反应缓冲液
25 mL×1瓶
YC4041-25
2-8℃
试剂
10%蔗糖溶液（w/v）
50 mL×1瓶
C1061-50
2-8℃
试剂
1%TTC显色液
5 mL×1瓶
YC4042-5
避光/2-8℃
质粒
pSUC2
50 µL×1支
PS1029
-20℃
pSUC2-Avr1b
50 µL×1支
PS1028
-20℃
酵母感受态
YKT12 Chemically Competent Cell
100 µL×20支
YC1170-20
-80℃
pYES2 (control vector, 10 ng/μl)
10 µL×1支
-20℃
Carrier DNA (10 μg/μl)
100 µL×2支
-20℃
PEG/LiAC
5 mL×2支
4℃
说明书
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1份
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产品特点
本试剂盒可用于检测信号肽是否具有分泌功能，简单高效。包含了信号肽分泌检测所需的全部培养基、试剂、菌株和载体。
操作步骤
一、培养基配制
CMD-W Broth液体培养基：取CMD-W Broth培养基一袋，加蒸馏水450 mL搅拌溶解后，定容到0.5 L（不用调pH值），121℃-15 min高压灭菌，灭菌后温度降到30℃以下使用。
CMD-W with Agar固体培养基：取CMD-W with Agar培养基一袋，加蒸馏水450 mL溶解（Agar不溶），定容到0.5 L（不用调pH值），121℃-15 min灭菌，灭菌后温度降到55度以下倒平板即可。
YPRAA with Agar固体培养基：取YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)一袋，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L（不用调pH值），121℃-15 min高压灭菌，温度降到55℃以下加入20%棉子糖溶液50 mL，倒平板即为YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)平板；每100 mL YPRA培养基中加入1 mg/mL的抗霉素A溶液5 µL，倒平板即为YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)平板。
二、实验方法
1. 载体构建
将待验证基因的信号肽区域SP构建到pSUC2载体EcoRI & XhoI之间，即为实验pSUC2-SP。pSUC2载体信息参见本公司官网。
2. 酵母转化
（1）Carrier DNA的预处理：将Carrier DNA插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
（2）取100 µL冰上融化的YKT12感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30℃水浴30 min（15 min时翻转6-8次混匀）。
（3）将管放42℃水浴15 min（7.5 min时翻转6-8次混匀）。
（4）5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。
（5）ddH2O 50 µL重悬，涂CMD-W板，29℃培养48-96 h。
按表2将质粒分别转入酵母YKT12感受态细胞。
表2 酵母转化质粒
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质粒 |
培养基 |
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pSUC2 |
CMD/-W with Agar |
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pSUC2-Avr1b |
同上 |
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pSUC2-SP |
同上 |
3. 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可选做，也可忽略不做，鉴定引物可使用T7：TAATACGACTCACTATAGG；ADH1 promoter-F：CGGTATACGG CCTTCCTTCC，pSUC2空载体PCR条带大小为：288 bp，pSUC2-SP需加上信号肽序列长度。
4. 信号肽分泌检测
（1）转化后，将酵母细胞铺布在CMD-W培养基板上，于30℃倒置培养48-72 h；
（2）挑选较大的阳性单菌落于CMD-W液体培养基中振荡培养过夜；
（3）取1 mL菌液，5000 rmp离心1 min，弃上清，并用灭菌ddH2O洗涤三次，调OD600为0.5，用ddH2O进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍（即OD600为0.05、0.005、0.0005、0.00005）。
（4）按照顺序分别取5 μL点板至CMD-W、YPRA以及YPRAA培养基上，30℃培养2-5 d（其中YPRAA平板需培养5-6 d），观察酵母生长状态。
【注意：YKT12感受态在CMD-W平板或其他缺色氨酸/Trp的平板上容易长出假阳性菌落，假阳性菌落偏小，应避开小菌落，挑较大的阳性单菌落，并对选中的菌落应做好标记或保种，以备下次使用；平板要事先倒好，打开盖子在超净台吹1小时后点板，每个位置点5ul，不可点样过多，菌液过多或平板不干会导致菌液不易干，相邻位置的菌液扩散后容易连成片或菌液扩散形状不规则，一般点样后2分钟内干燥为宜。】
（5）另取1.5 mL菌液，5000 rpm离心1 min，弃上清，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
（6）用750 μL无菌ddH2O重悬，加入250 μL TTC反应缓冲液，500 μL10%蔗糖溶液（w/v），在37°C下孵育10分钟。
（7）5000 rpm离心1 min，取100 μL上清液，于1.5 mL离心管中，加入900 μL 0.1%TTC溶液(用1 M NaOH稀释至0.1%)，室温孵育5分钟。如果信号肽功能正常，则会观察到溶液变红色，而携带pSUC2载体的YTK12菌株则不会观察到红色或红色很弱（室温孵育时间要做预试验确认，一般控制在20分钟以内）。
5. 示例结果分析
阳性对照YTK12（pSUC2-Avr1b）可以在YPRAA（含琼脂粉，含抗霉素A）培养基上生长，阴性对照YTK12（pSUC2）在YPRAA（含琼脂粉，含抗霉素A）平板上生长状态弱于阳性对照；阳性对照YTK12（pSUC2-Avr1b）分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成单糖，单糖与TTC反应变成红色且不溶于水的氯化三苯基四氮唑。阴性对照YTK12（pSUC2）不分泌蔗糖酶，因此不能与TTC发生显色反应（图1）。如实验组pSUC2-SP与阳性对照结果一致，则表明该基因的信号肽具有分泌功能。反之，则表明该基因的信号肽不具有分泌功能。
图1 Avr1b信号肽功能验证（本公司验证结果）
6. 若没有观察到预期表型，可能原因分析如下：
（1）目标基因无相关功能；
（2）目标基因功能较弱，需要优化TTC浓度、孵育时间，或其他试验条件；
（3）目标基因无表达，或表达量弱，可western blot检测目标基因是否表达，若没有表达，需要重新优化密码子构建酵母表达质粒。
注意事项
1. 点板之前，阴性对照、阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照、阳性对照与试验组的OD值一定要调一致。
2. 稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。
3. TTC不能在水中长期保存，使用时将1%TTC用1 M NaOH稀释至0.1%使用。
4. 最后一步显色反应，加入TTC溶液，室温孵育的时间要做预试验确认，一般控制在20分钟以内。
参考文献
[1] Jacobs KA, Collins-Racie LA, Colbert M, et al. A genetic selection for isolating cDNAs encoding secreted proteins. Gene. 1997 Oct 1;198(1-2):289-96.
[2] Daolong D ,D S K ,Xia W , et al. RXLR-mediated entry of Phytophthora sojae effector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery. [J]. The Plant cell, 2008, 20 (7): 1930-47.
