酿酒酵母感受态细胞
产品说明
EBY.VW4000菌株来源于CEN.PK2-1C酵母菌株，MATa型，Transformation marker为ura3，可用于筛选标记为URA3的质粒的转化，比如pYES2/NT、pYC2/NT、pDR196、p416GDP、pESC-URA等质粒。酿酒酵母含有大量严格控制的具有不同特征的己糖转运蛋白，这些己糖转运蛋白有转运葡萄糖的潜力，大部分酵母中含有17个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1-HXT17，CEN.PK2-1C只含有16个己糖转运蛋白（Hexose transporter）HXT1-HXT16；GAL2：半乳糖渗透酶基因，为半乳糖利用所必须，同时具有运输葡萄糖的功能；还有三个麦芽糖转运蛋白家族成员（Agt1、Ydl247、Yjr160）能够运输己糖；此外，STL1（Sugar Transporter-Like protein）为质膜甘油质子同向转运体，也被认为参与到葡萄糖的转运代谢过程中。为了消除CEN.PK2-1C酵母对葡萄糖的摄取能力，利用Cre/LoxP系统将HXT1-HXT16、GAL2、AGT1、YDL247w和YJR160c这些能够运输己糖的基因，加上STL1共21个基因全部删除，即是EBY.VW4000。EBY.VW4000作为己糖转运蛋白缺陷酵母菌株，其葡萄糖的吸收和转运活性被完全消除，其他己糖的吸收和转运能力也被消除，是发现和研究天然或异源（其他物种）己糖转运蛋白的高效试验平台。EBY.VW4000不能同化葡萄糖或其他己糖作为碳源，在含有2%麦芽糖的培养基中生长正常。
pDR196是酿酒酵母蛋白高效表达载体，筛选标记为Ura3。将己糖转运蛋白编码的基因X构建到pDR196 载体中（pDR196-X），将其转化EBY.VW4000感受态细胞，蛋白就会促进酵母吸收利用培养基中的己糖，进而使得EBY.VW4000酵母菌能够在只含己糖培养基中正常生长。
产品规格
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产品名称 |
产品货号 |
产品价格 |
说明书下载 |
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EBY.VW4000酵母己糖转运活性检测试剂盒 |
YCK7140 |
3880 |
 |
产品内容
|
组分类别 |
组分名称 |
规格 |
货号 | 储存温度 |
|
培养基 |
SM/-Ura with Agar（含麦芽糖） |
55 g×1瓶 |
YM5104S-2L |
RT |
|
SD/-Ura with Agar（含葡萄糖） |
0.5 L×1袋 |
YM3104S |
RT |
|
|
SF/-Ura with Agar（含果糖） |
55 g×1瓶 |
YM6104S-2L |
RT |
|
| SM/-Ura Broth（含麦芽糖） | 15 g×1瓶 |
YM5104L-2L |
RT |
|
| 质粒 | pDR196质粒 | 50 µL×1支 |
PS2011 |
-20℃ |
| pDR196-AtSWEET4质粒 | 50 µL×1支 |
PS2012 |
-20℃ |
|
| 酵母感受态 | EBY.VW4000 Chemically Competent Cell | 100 µL×20支 |
YC1140 |
-80℃ |
| pYES2 (control vector, 10 ng/μl) | 10 µL×1支 |
-20℃ |
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| Carrier DNA (10 μg/μl) | 100 µL×2支 |
-20℃ |
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| PEG/LiAC | 5 mL×2支 |
4℃ |
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| 说明书 | / | 1份 |
/ |
/ |
产品特点
本试剂盒可用于检测蛋白是否具有己糖转运活性，简单高效。包含了己糖转运活性检测所需的全部试剂、菌株和载体。
操作步骤
一、培养基配制（试剂盒中的培养基为预混培养基，PH值固定为5.8±0.1，不用实验者调ph值）
SM/-Ura液体培养基：取SM/-Ura Broth培养基3.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后补加20%麦芽糖溶液50 mL，温度降到30℃以下使用。
SD/-Ura with Agar固体培养基：取SD/-Ura with Agar培养基一袋，加蒸馏水450 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.5 L，121℃-15min灭菌，温度降到55度以下倒平板即可。
SM/-Ura固体培养基：取SM/-Ura Broth培养基13.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后加20%麦芽糖溶液50 mL，温度降到55℃以下倒平板即可。
SF/-Ura固体培养基：取SF/-Ura Broth培养基13.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后补加20%果糖溶液50 mL，温度降到55℃以下倒平板即可。
二、实验方法
1. 载体构建
将目的基因X的CDS构建到pDR196载体中，即为实验组pDR196-X。pDR196载体信息参考本公司官网。
2. 酵母转化
（1）Carrier DNA的预处理：将Carrier DNA插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
（2）取100 µL冰上融化的EBY.VW4000感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30℃水浴30 min （15 min时翻转6-8次混匀）。
（3）将管放42℃水浴15 min（7.5 min时翻转6-8次混匀）。
（4）5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30s弃上清。
（5）ddH2O 50 µL重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择），29℃培养48-96 h。
按表2将各个质粒分别转入酵母EBY.VW4000感受态细胞。
表2 酵母转化质粒
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质粒 |
培养基 |
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pDR196 |
SM/-Ura with Agar |
|
pDR196-AtSWEET4 |
同上 |
|
pDR196-X |
同上 |
3. 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可选做，也可忽略不做，鉴定引物可使用M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT和T7 R：CCTATAGTGAGTCGTATTA，实际扩增条带大小为383 bp。
4. 己糖转运活性检测
（1）在每个平板中挑取新鲜单菌落，用SM/-Ura Broth（含麦芽糖）液体培养基过夜培养，OD600为1-2之间。
（2）6000g 离心1 min，弃上清。用灭菌ddH2O洗涤三次，并稀释至OD600为0.5。
（3）用ddH2O依次稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍（即OD600=0.5，0.05，0.005，0.0005，0.00005）。
（4）按照先后顺序，分别取5 μL在含不同糖的平板（SM/-Ura、SD/-Ura、SF/-Ura）上点板。
（5）28-30℃培养2-5 d，观察每个样品在不同筛选平板上的生长状况，确定目标蛋白是否具有糖转运活性。
【注意：应挑中等大小的菌落，不要挑过大或过小的菌落，不同菌落得到的结果会有差异，所以对选中的菌落应做好标记或保种，以备下次使用；平板要事先倒好，打开盖子在超净台吹1小时后点板，每个位置点5ul，不可点样过多，菌液过多或平板不干会导致菌液不易干，相邻位置的菌液扩散后容易连成片或菌液扩散形状不规则，一般点样后2分钟内干燥为宜。】
5. 示例结果分析将阳性对照（pDR196-SWEET4）、阴性对照（pDR196）载体分别转化 EBY.VW4000 感受态细胞。EBY.VW4000（pDR196-SWEET4）、EBY.VW4000（pDR196）在 SM/-Ura（含麦芽糖）培养基均能够正常生长；在 SD/-Ura（含葡萄糖）培养基、SF/-Ura（含果糖）培养基中，EBY.VW4000（pDR196-SWEET4）可以正常生长，而EBY.VW4000（pDR196）的生长受到抑制，因为SWEET4具有己糖转运活性，SWEET4的表达促进了酵母吸收、利用葡萄糖和果糖（如图1）。
图1 AtSWEET4己糖转运活性检测（本公司验证结果）
6. 若没有观察到预期表型，可能原因分析如下：
（1）目标基因无相关功能；
（2）目标基因功能较弱，需要优化糖浓度，或其他试验条件；
（3）目标基因无表达，或表达量弱，可western blot检测目标基因是否表达，若没有表达，需要重新优化密码子构建酵母表达质粒。
注意事项
1. 点板之前，阴性对照、阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照、阳性对照与试验组的OD值一定要调一致。
2. 稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。
参考文献
[1]Xiaozhu L ,Yan Z ,Chao Y , et al. AtSWEET4, a hexose facilitator, mediates sugar transport to axial sinks and affects plant development. [J]. Scientific reports, 2016, 6 (1): 24563.
[2]Daniel S ,Marcel B D V ,A G N K , et al. The genome sequence of the popular hexose-transport-deficient Saccharomyces cerevisiae strain EBY.VW4000 reveals LoxP/Cre-induced translocations and gene loss. [J]. FEMS yeast research, 2015, 15 (2):
[3]Li-Qing C ,Bi-Huei H ,Sylvie L , et al. Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens. [J]. Nature, 2010, 468 (7323): 527-32.
产品规格
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产品名称 |
产品货号 |
产品价格 |
说明书下载 |
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EBY.VW4000酵母己糖转运活性检测试剂盒 |
YCK7140 |
3880 |
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产品内容
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组分类别 |
组分名称 |
规格 |
货号 | 储存温度 |
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培养基 |
SM/-Ura with Agar（含麦芽糖） |
55 g×1瓶 |
YM5104S-2L |
RT |
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SD/-Ura with Agar（含葡萄糖） |
0.5 L×1袋 |
YM3104S |
RT |
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SF/-Ura with Agar（含果糖） |
55 g×1瓶 |
YM6104S-2L |
RT |
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| SM/-Ura Broth（含麦芽糖） | 15 g×1瓶 |
YM5104L-2L |
RT |
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| 质粒 | pDR196质粒 | 50 µL×1支 |
PS2011 |
-20℃ |
| pDR196-AtSWEET4质粒 | 50 µL×1支 |
PS2012 |
-20℃ |
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| 酵母感受态 | EBY.VW4000 Chemically Competent Cell | 100 µL×20支 |
YC1140 |
-80℃ |
| pYES2 (control vector, 10 ng/μl) | 10 µL×1支 |
-20℃ |
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| Carrier DNA (10 μg/μl) | 100 µL×2支 |
-20℃ |
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| PEG/LiAC | 5 mL×2支 |
4℃ |
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| 说明书 | / | 1份 |
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产品特点
本试剂盒可用于检测蛋白是否具有己糖转运活性，简单高效。包含了己糖转运活性检测所需的全部试剂、菌株和载体。
操作步骤
一、培养基配制（试剂盒中的培养基为预混培养基，PH值固定为5.8±0.1，不用实验者调ph值）
SM/-Ura液体培养基：取SM/-Ura Broth培养基3.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后补加20%麦芽糖溶液50 mL，温度降到30℃以下使用。
SD/-Ura with Agar固体培养基：取SD/-Ura with Agar培养基一袋，加蒸馏水450 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.5 L，121℃-15min灭菌，温度降到55度以下倒平板即可。
SM/-Ura固体培养基：取SM/-Ura Broth培养基13.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后加20%麦芽糖溶液50 mL，温度降到55℃以下倒平板即可。
SF/-Ura固体培养基：取SF/-Ura Broth培养基13.75 g，加蒸馏水400 mL搅拌溶解后（Agar不溶），定容到0.45 L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后补加20%果糖溶液50 mL，温度降到55℃以下倒平板即可。
二、实验方法
1. 载体构建
将目的基因X的CDS构建到pDR196载体中，即为实验组pDR196-X。pDR196载体信息参考本公司官网。
2. 酵母转化
（1）Carrier DNA的预处理：将Carrier DNA插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
（2）取100 µL冰上融化的EBY.VW4000感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，预处理后的Carrier DNA 10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30℃水浴30 min （15 min时翻转6-8次混匀）。
（3）将管放42℃水浴15 min（7.5 min时翻转6-8次混匀）。
（4）5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30s弃上清。
（5）ddH2O 50 µL重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择），29℃培养48-96 h。
按表2将各个质粒分别转入酵母EBY.VW4000感受态细胞。
表2 酵母转化质粒
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质粒 |
培养基 |
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pDR196 |
SM/-Ura with Agar |
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pDR196-AtSWEET4 |
同上 |
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pDR196-X |
同上 |
3. 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可选做，也可忽略不做，鉴定引物可使用M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT和T7 R：CCTATAGTGAGTCGTATTA，实际扩增条带大小为383 bp。
4. 己糖转运活性检测
（1）在每个平板中挑取新鲜单菌落，用SM/-Ura Broth（含麦芽糖）液体培养基过夜培养，OD600为1-2之间。
（2）6000g 离心1 min，弃上清。用灭菌ddH2O洗涤三次，并稀释至OD600为0.5。
（3）用ddH2O依次稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍（即OD600=0.5，0.05，0.005，0.0005，0.00005）。
（4）按照先后顺序，分别取5 μL在含不同糖的平板（SM/-Ura、SD/-Ura、SF/-Ura）上点板。
（5）28-30℃培养2-5 d，观察每个样品在不同筛选平板上的生长状况，确定目标蛋白是否具有糖转运活性。
【注意：应挑中等大小的菌落，不要挑过大或过小的菌落，不同菌落得到的结果会有差异，所以对选中的菌落应做好标记或保种，以备下次使用；平板要事先倒好，打开盖子在超净台吹1小时后点板，每个位置点5ul，不可点样过多，菌液过多或平板不干会导致菌液不易干，相邻位置的菌液扩散后容易连成片或菌液扩散形状不规则，一般点样后2分钟内干燥为宜。】
5. 示例结果分析将阳性对照（pDR196-SWEET4）、阴性对照（pDR196）载体分别转化 EBY.VW4000 感受态细胞。EBY.VW4000（pDR196-SWEET4）、EBY.VW4000（pDR196）在 SM/-Ura（含麦芽糖）培养基均能够正常生长；在 SD/-Ura（含葡萄糖）培养基、SF/-Ura（含果糖）培养基中，EBY.VW4000（pDR196-SWEET4）可以正常生长，而EBY.VW4000（pDR196）的生长受到抑制，因为SWEET4具有己糖转运活性，SWEET4的表达促进了酵母吸收、利用葡萄糖和果糖（如图1）。
图1 AtSWEET4己糖转运活性检测（本公司验证结果）
6. 若没有观察到预期表型，可能原因分析如下：
（1）目标基因无相关功能；
（2）目标基因功能较弱，需要优化糖浓度，或其他试验条件；
（3）目标基因无表达，或表达量弱，可western blot检测目标基因是否表达，若没有表达，需要重新优化密码子构建酵母表达质粒。
注意事项
1. 点板之前，阴性对照、阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照、阳性对照与试验组的OD值一定要调一致。
2. 稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。
参考文献
[1]Xiaozhu L ,Yan Z ,Chao Y , et al. AtSWEET4, a hexose facilitator, mediates sugar transport to axial sinks and affects plant development. [J]. Scientific reports, 2016, 6 (1): 24563.
[2]Daniel S ,Marcel B D V ,A G N K , et al. The genome sequence of the popular hexose-transport-deficient Saccharomyces cerevisiae strain EBY.VW4000 reveals LoxP/Cre-induced translocations and gene loss. [J]. FEMS yeast research, 2015, 15 (2):
[3]Li-Qing C ,Bi-Huei H ,Sylvie L , et al. Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens. [J]. Nature, 2010, 468 (7323): 527-32.
