SD-CAA with Agar (固体预混培养基) - 上海唯地生物技术有限公司

酵母展示相关培养基

培养基系列

SD-CAA with Agar (固体预混培养基)

产品说明

SD-CAA with Agar是一种适用于EBY100酵母菌株的半合成平板培养基，常用于酵母展示质粒文库转化EBY100感受态后的涂板试验。YNB提供氮源、维生素、微量元素；葡萄糖提供碳源；Casamino acids （酪蛋白水解物）提供除腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸外的各种必需氨基酸和核苷酸，部分维生素，微量元素；Na2HPO4/NaH2PO4磷酸盐提供缓冲环境，稳定PH值；山梨醇作为渗透压保护剂，提高平板的渗透压，平衡细胞内外渗透压，防止电击后膜穿孔的酵母发生渗透压裂解，帮助细胞膜修复，显著提高转化效率，是大容量文库构建最常用的平板培养基。

附言：常规容量文库（106级别文库），常用SD/-Trp/-Ura或YNB-CAA with glucose平板；大容量文库（107-108级别文库），常用SD-CAA平板。

产品规格

名称	货号	规格	目录价
SD-CAA with Agar	YEM7011S-01	5×0.5L/包	660

产品内容

包装名称	包装含量	包装数量	保存条件/时间
SD-CAA with Agar	106.85g (可配0.5L SD-CAA固体培养基)	5袋	室温干燥/24个月
	50%葡萄糖（100ml/瓶）	1瓶	室温干燥/12个月
	10×磷酸盐缓冲液（250ml/瓶）	1瓶	室温干燥/12个月

产品组分与配方

产品组分	SD-CAA with Agar配方/L
YNB(含硫酸铵，无氨基酸)	6.7g
Casamino acids（酪蛋白水解物）	5g
葡萄糖	20g
Na₂HPO₄（磷酸氢二钠）	5.4g
NaH₂PO₄（磷酸二氢钠）	7.44g
山梨醇	182g
Agar	15g

● PH值( 25°C)：6.0±0.2

使用方法

SD-CAA with Agar为SD-CAA固体培养基，配制方法：取SD-CAA with Agar培养基一袋，加蒸馏水400ml搅拌溶解后，定容到0.43L，121℃-15min高压灭菌，灭菌后温度降到65度以下，加入20ml 50%葡萄糖溶液、50ml 10×磷酸盐缓冲液，混匀后倒平板。

注意事项

1. 若发现有严重吸潮现象，停止使用或酌情增加用量。若配制少于0.5L，按比例加入即可。

2. 50%葡萄糖溶液、10×磷酸盐缓冲液均已经过0.22um滤膜过滤除菌，使用时必须在超净台或无菌环境中打开。

3. 使用过程中注意不要污染无菌母液，若发现有浑浊现象，必须重新过滤除菌后才能使用。

EBY100中Aga2p融合蛋白的诱导表达Protocol (for reference only)

EPY100菌株的培养可以用YPD也可以用Minimal Dextrose Plates (with leucine、tryptophan) ；

PYD1质粒转化EPY100感受态，筛选阳性菌落的平板可以用以下四种培养基的固体形式：SD/-Trp/-Ura with Agar（货号：YM3234S），Minimal Dextrose Plates (with leucine)（货号：YEM7021S），YNB-CAA with Agar (with glucose)（货号：YEM7001S），或SD-CAA with Agar（货号：YEM7011S），常用SD/-Trp/-Ura with Agar。Aga2p融合蛋白的诱导表达前的酵母细胞扩增步骤可以用以上四种培养基的液体形式，常用SD/-Trp/-Ura Broth（货号：YM3234L）或YNB-CAA Broth (with glucose)。

注意：PYD1质粒转化EPY100感受态的筛选培养基或融合蛋白诱导前的扩增步骤主要用来筛选出含有质粒的阳性菌落及蛋白诱导前扩增酵母细胞，用何种培养基影响不大；但是因试验展示的蛋白不同，诱导融合蛋白的最佳诱导培养基需要做预试验确认，不同的诱导培养基可能产生不同的诱导效果，下面列出常用的八种Aga2p融合蛋白诱导培养基：

培养基名称	货号	特点	培养基名称	货号	特点
SG/-Trp/-Ura Broth	YEM7134L	只添加半乳糖，菌生长慢	YNB-CAA Broth (with galactose)	YEM7001L	只添加半乳糖，菌生长慢
SGR/-Trp/-Ura Broth	YEM7234L	含半乳糖、棉子糖，菌生长快	SG-CAA Broth	YEM7012L	只添加半乳糖，菌生长慢
SDG/-Trp/-Ura Broth	YEM7334L	含葡萄糖、半乳糖，菌生长快	SGR-CAA Broth	YEM7013L	含葡萄糖、半乳糖、棉子糖，菌生长快
SDGR/-Trp/-Ura Broth	YEM7434L	含葡萄糖、半乳糖、棉子糖，菌生长快	SDG-CAA Broth	YEM7014L	含葡萄糖，半乳糖，菌生长快

更常用的诱导培养基是YNB-CAA Broth (with galactose)或SGR/-Trp/-Ura Broth。

下面以YNB-CAA Broth (with galactose)液体培养基为例简要介绍EBY100中Aga2p融合蛋白的诱导表达步骤：

1. 准备未转化质粒的EBY100，EBY100(含pYD1空载体)和EBY100(含pYD1-gene)三种菌落，其中EBY100、EBY100(含pYD1空载体)作为对照使用。

2. 酵母菌接种到10ml SD/-Trp/-Ura Broth或YNB-CAA Broth (with glucose)中（用50ml/100ml三角瓶），30°C、200rpm摇菌。

3. 第二天早晨测酵母在600nm处的吸光值。OD600应介于2-4之间，如果OD600低于2，继续摇菌，若高于4，取1ml酵母菌液重新接种到9ml YNB-CAA Broth(with galactose)液体培养基中继续摇菌到合适的浓度。

4. 在室温下超净台操作，将酵母培养物转移到离心管中，3000g离心5分钟，弃上清，吸干残液，注意不要污染。

5. 加入含有2%半乳糖的YNB-CAA Broth(with galactose)液体培养基，将细胞沉淀重悬到OD600=0.6-0.8，同时取OD600为0.6-0.8的酵母培养物4ml作为诱导前的对照组样品(0点)放冰中或4度，或离心后弃上清放-20度保存。

6. 可在20-25°C环境温度下200rpm诱导EBY100中目的蛋白的表达。注意：一般情况下，优先在20°C下诱导Aga2p融合蛋白的表达，某些特殊蛋白（比如有些蛋白表达会影响酵母的细胞周期，降低酵母生长速度；或低温影响其二级结构、蛋白表达速度）可以提高温度到25度。

7. 在48小时的诱导时间段内，每隔12h取样一次(0点样品已取)，在诱导的第12h、24h、36h、48h四个时间点各取一次样品(注意：取样的量要与0点取样一致，可根据OD600值计算每个取样时间点所取样的体积)。Aga2p融合蛋白最快在菌体转移到半乳糖培养基后5h可以检测到，表达量高峰在12-48h，72h后酵母衰老、裂解会导致Aga2p融合蛋白降解，检测不到。

8. Aga2p融合蛋白检测：若做FITC染色，样品放冰中或4度保存，直到所有样品准备完毕，继续进行后面的染色步骤；若做western鉴定Aga2p融合蛋白的表达，所有样品可离心后保留沉淀，放-20度保存。

9. 实验者第一次操作本试验，最好准备EBY100、EBY100(含pYD1空载体)和EBY100(含pYD1-gene)三种菌落做对照试验，前两个对照组菌落可以只在0h、24h取两个样，EBY100(含pYD1-gene)菌落按步骤7中的时间点取样，也可每隔6h取样一次，根据染色或western实验找到Aga2p融合蛋白最大表达量的时间点。操作熟练后可以不设对照组。