产品规格和内容

产品组分与配方

培养基配制方法

     YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)（唯地货号：YM8013S）为固体培养基，取YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)一袋，加蒸馏水450ml搅拌溶解后，定容到0.5L(不用调ph值)，121℃-15min高压灭菌，灭菌后温度降到55度以下加入20%棉子糖溶液50ml，每100mlYPRA培养基中加入1mg/ml的抗霉素 A溶液5-200ul，倒平板即为YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)（唯地货号：YM8014S）平板。在做YTK12验证分泌信号肽功能的试验时，若加2μg/mL抗霉素A，酵母不能正常生长，我们推荐添加0.05μg/mL，客户也可做梯度试验确定最佳的使用浓度。

注意事项

1. 抗霉素A固体、溶液不可高压灭菌；不可放室温长期保存，可低温保存。

抗霉素A使用方法

一，用YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)培养基验证TYK12酵母系统分泌信号肽功能（pSUC2载体，唯地货号：PS1029；pSUC2-Avr1b载体，唯地货号：PS1028）：

  1. 从CMD-W（唯地货号：YM8012S）或SD/-Trp（唯地货号：YM3103S）平板挑选阳性单菌落接种到CMD-W液体培养基中振荡培养过夜。

  2. 取1 mL菌液，5000 rmp离心1 min，弃上清，并用灭菌ddH₂O洗涤三次，调OD₆₀₀为0.5，用ddH₂O进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍（即OD₆₀₀为0.05、0.005、0.0005）。

  3. 按照顺序分别取5 ul点到CMD-W、YPRAA平板上，30℃培养3-5 d，观察酵母菌落形态：若试验组的信号肽有功能，可在YPRAA平板上长出正常菌落；若无功能，在YPRAA平板上不长或生长势弱。

  4. 另取1.5 mL菌液，5000 rpm离心1 min，弃上清，加入1.5 mL无菌ddH₂O洗涤三次。

  5. 用750 ul无菌水重悬，加入250 ul TTC反应缓冲液，500 ul 10%蔗糖溶液（w/v），在37°C孵育10分钟。

  6. 5000 rpm离心1 min，取100 μL上清液，于1.5 mL离心管中，加入900 μL 0.1%TTC溶液(用TTC稀释液稀释至0.1%)，室温孵育5分钟。如果信号肽功能正常，则会观察到溶液变红色，而携带pSUC2载体的YTK12菌株则不会观察到红色或红色很弱（孵育时间要做预试验确认，一般控制在20分钟以内，时间过长，阴性对照也会变色）。

关于抗霉素A

1. 功能：抑制酵母线粒体呼吸链，迫使酵母依赖发酵代谢（而非有氧呼吸）利用碳源。

2. 原理：抗霉素 A 通过结合线粒体复合体 III，阻断电子传递链，抑制有氧呼吸产生 ATP；此时酵母需通过发酵棉子糖（经蔗糖酶水解后）生成 ATP，间接 “强化” 蔗糖酶的分泌需求，确保检测信号（如 TTC 显色）更明显。

3. 使用浓度：部分文献或产品说明书中推荐使用浓度为2μg/mL，但在做YTK12验证分泌信号肽功能的试验时，抗霉素A的可用浓度范围为0.05-2 ug/ml，结果差异不大，我们推荐添加0.05μg/mL，客户也可做梯度试验确定最佳使用浓度。