毕赤酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: PC1033）
PichiaPink 3 Chemically Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
pPink-LC (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
PD Buffer 15ml 保存： 4℃（3个月）
PN Buffer 18ml 保存： 4℃（3个月）
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
PichiaPink 3 感受态细胞 |
PC1033S |
10×100ul |
 |
| PC1033M | 50×100ul |
基因型
ade2, prb1
产品说明
PichiaPink 3菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。PichiaPink 3是腺嘌呤缺陷型菌株，基因组中腺嘌呤合成途径相关基因2位点产生突变，自身无法合成腺嘌呤；部分携带ADE2筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPink-HC/pPink-LC/pPinkα-HC等）可以表达ADE2基因，与PichiaPink 3互补，通过腺嘌呤缺陷培养基(PD/PAD)来筛选整合成功的阳性转化子。ADE2 基因的编码产物为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶，该酶催化嘌呤核苷酸从头合成途径中的第六步反应 —— 将磷酸核糖氨基咪唑（AIR）羧化为磷酸核糖氨基咪唑羧酸（CAIR），是腺嘌呤和鸟嘌呤合成的必需步骤。若该基因发生突变，酵母会因嘌呤合成受阻，成为腺嘌呤营养缺陷型菌株，当 ade2 突变菌株处于腺嘌呤缺乏环境时，嘌呤合成前体物质（如磷酸核糖氨基咪唑）会在细胞内积累并转化为色素，使菌落呈现红色；转化了相关质粒的酵母可以提供有活性的ADE2蛋白，互补腺嘌呤缺陷表型，嘌呤合成正常，菌落为白色，所以可以根据菌落颜色判断质粒拷贝数，白色菌落为高拷贝，粉色菌落为中低拷贝。此外，PichiaPink 3菌株还突变了prb1(蛋白水解酶B)基因，能有效保护重组蛋白免受降解。针对具体的蛋白，很难预测是高拷贝的毕赤酵母菌落还是低拷贝毕赤酵母菌落作为宿主进行蛋白表达更好，虽然高拷贝酵母菌转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；虽然低拷贝的酵母菌转录得到的mRNA更少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质。PichiaPink 3化转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPink-LC质粒（7.7kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的PichiaPink 3感受态细胞，依次加入预冷的线性化质粒2-10 µg(加入DNA的体积不超过10ul，DNA纯度越高越好)，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PD Buffer 1.4ml并吸打几次混匀，30℃水浴60 min (30 min翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，加入PN Buffer 1.4ml重悬，离心 30s弃上清。
5. 加入PN Buffer 0.3ml重悬，若平板较多可直接涂板；若平板较少，可5000 rpm离心30秒，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到合适的营养缺陷型筛选平板或含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基选择
PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4010S
PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4020S
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPink-LC质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SpeI/EcoN I/Afl II在TRP2 位点进行线性化。
3. 关于pPink系列毕赤酵母菌株筛选阳性菌落的筛选培养基：PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，筛选的酵母菌落生长偏慢；PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，菌落生长速度更快。
4. PichiaPink 3酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降，同时也不利于蛋白表达。
|
产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
|
PichiaPink 3 感受态细胞 |
PC1033S |
10×100ul |
|
| PC1033M | 50×100ul |
基因型
ade2, prb1
产品说明
PichiaPink 3菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。PichiaPink 3是腺嘌呤缺陷型菌株，基因组中腺嘌呤合成途径相关基因2位点产生突变，自身无法合成腺嘌呤；部分携带ADE2筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPink-HC/pPink-LC/pPinkα-HC等）可以表达ADE2基因，与PichiaPink 3互补，通过腺嘌呤缺陷培养基(PD/PAD)来筛选整合成功的阳性转化子。ADE2 基因的编码产物为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶，该酶催化嘌呤核苷酸从头合成途径中的第六步反应 —— 将磷酸核糖氨基咪唑（AIR）羧化为磷酸核糖氨基咪唑羧酸（CAIR），是腺嘌呤和鸟嘌呤合成的必需步骤。若该基因发生突变，酵母会因嘌呤合成受阻，成为腺嘌呤营养缺陷型菌株，当 ade2 突变菌株处于腺嘌呤缺乏环境时，嘌呤合成前体物质（如磷酸核糖氨基咪唑）会在细胞内积累并转化为色素，使菌落呈现红色；转化了相关质粒的酵母可以提供有活性的ADE2蛋白，互补腺嘌呤缺陷表型，嘌呤合成正常，菌落为白色，所以可以根据菌落颜色判断质粒拷贝数，白色菌落为高拷贝，粉色菌落为中低拷贝。此外，PichiaPink 3菌株还突变了prb1(蛋白水解酶B)基因，能有效保护重组蛋白免受降解。针对具体的蛋白，很难预测是高拷贝的毕赤酵母菌落还是低拷贝毕赤酵母菌落作为宿主进行蛋白表达更好，虽然高拷贝酵母菌转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；虽然低拷贝的酵母菌转录得到的mRNA更少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质。PichiaPink 3化转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPink-LC质粒（7.7kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。
2. 取100 µl冰上融化的PichiaPink 3感受态细胞，依次加入预冷的线性化质粒2-10 µg(加入DNA的体积不超过10ul，DNA纯度越高越好)，预处理后的Carrier DNA 10 µl，PD Buffer 1.4ml并吸打几次混匀，30℃水浴60 min (30 min翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴20 min (10 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，加入PN Buffer 1.4ml重悬，离心 30s弃上清。
5. 加入PN Buffer 0.3ml重悬，若平板较多可直接涂板；若平板较少，可5000 rpm离心30秒，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到合适的营养缺陷型筛选平板或含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基选择
PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4010S
PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4020S
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPink-LC质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SpeI/EcoN I/Afl II在TRP2 位点进行线性化。
3. 关于pPink系列毕赤酵母菌株筛选阳性菌落的筛选培养基：PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，筛选的酵母菌落生长偏慢；PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，菌落生长速度更快。
4. PichiaPink 3酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降，同时也不利于蛋白表达。
