SDGR/–Trp/–Ura Broth(for EBY100) (液体预混培养基粉剂)

酵母展示相关培养基

培养基系列

产品说明

SDGR/–Trp/–Ura Broth (for EBY100)是一种由确定成分组成的全合成酵母培养基，只缺失L-色氨酸、尿嘧啶，含有除L-色氨酸、尿嘧啶外的必需氨基酸和腺嘌呤，因此可以用来筛选含有表达L-色氨酸、尿嘧啶合成基因的酵母菌株，是专门设计供EBY100菌株诱导表达蛋白使用的诱导培养基，主要用于pYD1等质粒的诱导表达试验。棉子糖和葡萄糖提供碳源（在Aga2p融合蛋白的诱导试验中，半乳糖主要是作为诱导剂起作用，虽然部分文献中提到半乳糖可以作为酿酒酵母的碳源使用，但EBY100利用半乳糖的能力很弱，在只有半乳糖作为碳源的环境中几乎不能生长，但可以继续表达融合蛋白直到自身储存的能量耗尽；棉子糖是酵母的优质碳源同时不会抑制酵母半乳糖诱导启动子的表达，有利于Aga2p融合蛋白的持续表达；葡萄糖是最好的碳源，但同时也是半乳糖诱导启动子的抑制剂，在SG-CAA 诱导培养基中添加少量的葡萄糖可以提高菌体活力，增加融合蛋白的表达量，在葡萄糖存在时酵母快速繁殖，储存能量，当葡萄糖耗尽时菌体处于最佳的生长状态，在半乳糖的诱导下表达大量融合蛋白）。

产品规格

名称	货号	规格	目录价
SDGR/–Trp/–Ura Broth(for EBY100)	YEM7434L-01	5×0.5L/包	640
SDGR/–Trp/–Ura Broth(for EBY100)	YEM7434L-02	10×0.5L/包	1120

产品内容

包装名称	包装含量	包装数量	保存条件/时间
SDGR/–Trp/–Ura Broth(for EBY100)	4.2g (可配0.5L 液体培养基)	5袋/10袋	室温干燥/12个月
	20%半乳糖溶液（过滤除菌）	250ml/500ml	室温干燥/12个月
	20%棉子糖（过滤除菌）	250ml/500ml	室温干燥/12个月
	50%葡萄糖溶液（过滤除菌）	5ml/10ml	室温干燥/12个月

产品组分与配方

产品组分	SDGR/–Trp/–Ura Broth配方/L
YNB(无氨基酸)	6.7g
DO Supplement–Trp/–Ura (for EBY100)	1.35g
维生素	适量
微量元素	适量
半乳糖	20g
棉子糖	20g
葡萄糖	1g

PH值( 25°C)：5.8±0.1

使用方法

取SDGR/–Trp/–Ura Broth (for EBY100)培养基一袋（4.2g），加蒸馏水450ml搅拌溶解后，定容到0.4L(不用调ph值)，121℃ -15min高压灭菌，灭菌后温度降到55度以下，加入已过滤除菌的葡萄糖溶液1ml、半乳糖溶液50ml、棉子糖溶液50ml。

注意事项

1. 若发现有严重吸潮现象，停止使用或酌情增加用量。若配制少于0.5L，按比例加入即可。

EBY100中Aga2p融合蛋白的诱导表达Protocol (for reference only)

EPY100菌株的培养可以用YPD也可以用Minimal Dextrose Plates (with leucine、tryptophan) ；

PYD1质粒转化EPY100感受态，筛选阳性菌落的平板可以用以下四种培养基的固体形式：SD/-Trp/-Ura with Agar（货号：YM3234S），Minimal Dextrose Plates (with leucine)（货号：YEM7021S），YNB-CAA Medium (with glucose)（货号：YEM7001S），或SD-CAA medium（货号：YEM7011S），常用SD/-Trp/-Ura with Agar。Aga2p融合蛋白的诱导表达前的酵母细胞扩增步骤可以用以上四种培养基的液体形式，常用SD/-Trp/-Ura Broth（货号：YM3234L）或YNB-CAA Medium (with glucose)。

注意：PYD1质粒转化EPY100感受态的筛选培养基或融合蛋白诱导前的扩增步骤主要用来筛选出含有质粒的阳性菌落及蛋白诱导前扩增酵母细胞，用何种培养基影响不大；但是因试验展示的蛋白不同，诱导融合蛋白的最佳诱导培养基需要做预试验确认，不同的诱导培养基可能产生不同的诱导效果，下面列出常用的八种Aga2p融合蛋白诱导培养基：

培养基名称	货号	特点	培养基名称	货号	特点
SG/-Trp/-Ura Broth	YEM7134L	只添加半乳糖，菌生长慢	YNB-CAA Medium (with galactose)	YEM7001L	只添加半乳糖，菌生长慢
SGR/-Trp/-Ura Broth	YEM7234L	含半乳糖、棉子糖，菌生长快	SG-CAA medium	YEM7012L	只添加半乳糖，菌生长慢
SDG/-Trp/-Ura Broth	YEM7334L	含葡萄糖、半乳糖，菌生长快	SGR-CAA medium	YEM7013L	含半乳糖，棉子糖，菌生长快
SDGR/-Trp/-Ura Broth	YEM7434L	含葡萄糖、半乳糖、棉子糖，菌生长快	SDG-CAA medium	YEM7014L	含葡萄糖、半乳糖、棉子糖，菌生长快

更常用的诱导培养基是YNB-CAA Medium (with galactose)或SGR/-Trp/-Ura Broth。

下面以YNB-CAA Medium (with galactose)液体培养基为例简要介绍EBY100中Aga2p融合蛋白的诱导表达步骤：

1. 准备未转化质粒的EBY100，EBY100(含pYD1空载体)和EBY100(含pYD1-gene)三种菌落，其中EBY100、EBY100(含pYD1空载体)作为对照使用

2. 酵母菌接种到10ml SD/-Trp/-Ura Broth或YNB-CAA (with glucose)中（用50ml 或100ml三角瓶），30°C、200rpm过夜摇菌。

3. 第二天早晨测酵母在600nm处的吸光值。OD600应介于2-4之间，如果OD600低于2，继续摇菌，若高于4，取1ml酵母菌液重新接种到9ml YNB-CAA Medium(with galactose)液体培养基中继续摇菌到合适的浓度。

4. 在室温下超净台操作，将酵母培养物转移到离心管中，3000g离心5分钟，弃上清，吸干残液，注意不要污染。

5. 加入含有2%半乳糖的YNB-CAA Medium(with galactose)液体培养基，将细胞沉淀重悬到OD600=0.6-0.8，同时取OD600为0.6-0.8的酵母培养物4ml作为诱导前的对照组样品(0点)放冰中或4度，或离心后弃上清放-20度保存。

6. 可在20-25°C环境温度下200rpm诱导EBY100中目的蛋白的表达。注意：一般情况下，优先在20°C下诱导Aga2p融合蛋白的表达，某些特殊蛋白（比如有些蛋白表达会影响酵母的细胞周期，降低酵母生长速度；或低温影响其二级结构、蛋白表达速度）可以提高温度到25度。

7. 在48小时的诱导时间段内，每隔12h取样一次(0点样品已取)，在诱导的第12h、24h、36h、48h四个时间点各取一次样品(注意：取样的量要与0点取样一致，可根据OD600值计算每个取样时间点所取样的体积)。Aga2p融合蛋白最快在菌体转移到半乳糖培养基后5h可以检测到，表达量高峰在12-48h，72h后酵母衰老、裂解会导致Aga2p融合蛋白降解，检测不到。

8. Aga2p融合蛋白检测：若做FITC染色，样品放冰中或4度保存，直到所有样品准备完毕，继续进行后面的染色步骤；若做western鉴定Aga2p融合蛋白的表达，所有样品可离心后保留沉淀，放-20度保存。

9. 实验者第一次操作本试验，最好准备EBY100、EBY100(含pYD1空载体)和EBY100(含pYD1-gene)三种菌落做对照试验，前两个对照组菌落可以只在0h、24h取两个样，EBY100(含pYD1-gene)菌落按步骤7中的时间点取样，也可每隔6h取样一次，根据染色或western实验找到Aga2p融合蛋白最大表达量的时间点。操作熟练后可以不设对照组。