产品规格

产品组分与配方

PH值( 25°C)：7.0±0.2，本产品加入PH7.0的去离子水后PH接近7.0，可不调ph值直接使用。

产品说明

   AIM-DIP Broth：唯地生物开发，适合富含二硫键的蛋白表达的自诱导培养基。在其中补充含有更多小肽的蛋白胨、酵母粉、非蛋白分子伴侣、氨基酸混合物、硫胺素、腺嘌呤、葡萄糖、乳糖、镁离子、钠离子、钾离子、胱氨酸、GSH、GSSG配制成AIM-DIP Broth，主要用于大肠杆菌中由T7启动子诱导蛋白表达的试验（或IPTG诱导蛋白表达的试验）。与传统的LB-IPTG蛋白诱导方法不同，自诱导培养基允许T7启动子系统的自动调节，诱导表达，无需检测培养基中菌体OD值，无需添加IPTG，并且蛋白表达量比IPTG诱导的蛋白量更高。

   自诱导培养基作用机制：在葡萄糖存在时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，葡萄糖作为半乳糖操纵子的阻遏因子阻止细菌利用α-乳糖，促进高密度生长。一旦培养基中的葡萄糖被耗尽（通常发生在对数中后期），乳糖被ß-半乳糖苷酶转换成异乳糖（葡萄糖-1,6-半乳糖），而后者作为IPTG诱导型启动子的诱导剂，促进乳糖阻遏物从启动子的DNA结合位点上释放，启动重组蛋白的表达。对于含有DE3元件的大肠杆菌，异乳糖使T7lac启动子去阻遏，诱导lacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶。通过这种方式，在原核表达菌生长到某一特定点时蛋白表达自发开始，无需监测细胞密度（OD600）和

添加IPTG。与传统IPTG诱导的蛋白表达过程相比，使用自动诱导培养基极大地方便和简化了试验流程。

注意：哪种自诱导培养基更适合目标蛋白的表达需要做预试验确认，不同蛋白需要不同的自诱导培养基进行诱导表达，很难在诱导之前预测结果。

AIM-DIP Broth自诱导培养基的工作原理

1. 当需要在大肠杆菌细胞质中表达富含二硫键的蛋白时，向培养基中补充特定比例的GSH和GSSG，可调控细胞内氧化还原环境，促进二硫键正确折叠，提高蛋白可溶性。大肠杆菌的细胞质天然是一个强还原性环境，这能防止胞内蛋白质的巯基被意外氧化，但对于需要在胞质中形成二硫键的重组蛋白来说，这会导致二硫键无法形成，或形成后立刻被还原。补充GSH/GSSG混合物可以改变胞质的氧化还原平衡，使其从一个强还原状态转变为一个允许并促进二硫键缓慢、正确形成的“适度氧化”状态。GSH/GSSG水溶液易失活，只能现配先用，配成水溶液后用0.45um的滤头过滤除菌，GSH、GSSG可分别配成100mM、10mM的水溶液后过滤除菌（若不能完全溶解，可用微波炉加热促溶，注意不要让温度超过70度）。GSH/GSSG应按比例使用，有两种固定的比例：1，GSH（5mM即1.5g/L）+GSSG（0.5mM即0.3g/L）；2， GSH（2mM即0.6g/L）+GSSG（0.5mM即0.3g/L），前者高效还原错误形成的二硫键，适用于二硫键结构简单、对错误折叠敏感的蛋白；后者提供更强的氧化力，有利于形成二硫键，适用于二硫键多且复杂、难以氧化的蛋白。

2. 当需要在大肠周质空间中表达富含二硫键的蛋白时，在培养基中添加L-胱氨酸有助于维持周质空间的氧化环境，L-胱氨酸可以被转运到周质空间，直接被DsbA等酶利用，促进目标蛋白的二硫键快速形成，促进蛋白形成正确构象。试剂盒中的100mM L-胱氨酸溶液已经过滤除菌，可直接使用，使用浓度为2mM。

使用方法

     取AIM-DIP Broth 粉剂培养基一袋，加适量双蒸水溶解后（溶液体积根据后续补加溶液体积计算，一袋培养基对应总体积为0.5L），121℃-20min高压灭菌，灭菌后待温度降到60度以下，加入0.5ml AIM葡萄糖溶液，5ml AIM乳糖溶液，混匀后可根据目标蛋白的表达空间选择加入L-胱氨酸或GSH/GSSG。加入L-胱氨酸的培养基可保存一周；加入GSH、GSSG的培养基应立即使用，不可保存。

注意：非蛋白分子伴侣Ⅱ可加可不加，不同蛋白有不同的最适浓度，实验者可根据目标蛋白不同设置不同的浓度梯度，非蛋白分子伴侣Ⅱ的梯度一般为：0、1%、2%。

蛋白自诱导方法：

1. 准备含有目的质粒的原核表达大肠杆菌单菌落（可质粒转化感受态涂板，也可平板划线）。

2. 小摇接菌：将单菌落接种到含有1-3ml 含相应抗生素的液体LB/2YT的透气试管中。

3. 137℃，200 rpm过夜摇菌约10-24h，菌体摇浓，一般要求OD600>2.0。

4.  按2-5%的比例接菌到AIM-DIP Broth自诱导培养基中，

   A. 30-37度诱导：200-300rpm，摇菌8-24h。

   B. 15-25度诱导：200-300rpm，摇菌12-48h。

   C. 若所表达蛋白为毒性蛋白或菌体生长过慢，可先在37度摇菌，待菌体OD600=0.8左右时降低到目标温度。

5. 最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样检测蛋白表达量。

注意事项

1. AIM-DIP Broth自诱导培养基需先补水，121℃-20min高压灭菌后使用；若发现有严重吸潮现象，停止使用。

2. 少部分蛋白用自诱导培养基的方法诱导蛋白可能不如常规IPTG诱导表达系统，遇到此类蛋白可使用常规的IPTG诱导方法。

3. 大肠杆菌表达菌株必须含有lac操纵子（包括lacY和lacZ），如BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、TB1、Mg1655等；而T7 Express lysY等菌株不含完整的lac操纵子，不能使用自诱导培养基。