溶液AB1使用前需先加入RNaseA溶液，混匀，置2-8℃保存。

操作流程

1. 取 1–5 mL 农杆菌培养物，12000 rpm 离心 1 min，弃上清，吸干水份。加入250 μL的AB1，用移液器吹打混匀或涡旋振荡混匀。

2. 加入 250 µL AB2 裂解液轻轻颠倒混匀 6–8 次（不要振荡），室温放置 2-3 min，此时菌液应变得清亮粘稠。

3. 加入 350 µL AB3 中和液颠倒混匀6-8次，此时会出现白色絮状沉淀。12000 rpm 离心 10 min（如果上清中还有微小白色沉淀，可以再次离心后取上清）。

4. 上清转移至核酸纯化柱，12000 rpm离心 1 min 。

5. 步骤4的流出液重新倒入核酸纯化柱中，12000 rpm离心 1 min 。

6. 加入 500 µL RP去蛋白液，12000 rpm离心 1 min。

7. 加入 500 µL BW 漂洗液，12000 rpm离心 1 min。

8. 重复步骤7。

9. 再次离心（12000rpm，2 min）干燥柱膜，将纯化柱中的残余漂洗液去除。

10. 将纯化柱盖子打开，室温放置3分钟，以便纯化膜中的乙醇彻底挥发（此步骤可略过）。

11. 将纯化柱放置于一个干净的离心管中，向纯化膜中间部位加入25-50 µL洗脱液 EB，室温放置 2 min，12000 rpm离心2 min收集质粒（也可将洗脱液65℃预热，或将加入洗脱液的纯化柱和新离心管一起放入65℃金属浴5分钟，有助于提升洗脱效率）。

关于酵母质粒拷贝数及大肠扩繁质粒的说明

• 农杆菌中的质粒只有1-5个拷贝；而大肠杆菌中质粒拷贝数通常为50-500个/Cell；相同体积菌块提取的质粒，大肠是农杆菌的50-100倍。所以农杆菌提取的质粒无法通过电泳或分光光度计检测，也无法测序鉴定，无法酶切鉴定；可以作为PCR模板使用，也可以转化大肠杆菌扩繁质粒，通常建议使用量为：使用2-5μl用作PCR模板；使用5-10μl用于转化大肠杆菌。

• 转化大肠杆菌时应使用商业化的高效率感受态细胞（推荐唯地生物的DH5α Chemically Competent Cell，货号：DL1001；TOP10 Chemically Competent Cell，货号：DL1010）。

注意事项一

• 洗脱液体积不应少于25μL，体积过小影响回收效率。

• 洗脱液pH值应在7.0-8.5之间，pH低于7.0会影响洗脱效率。

• 加入AB2后不要剧烈振荡，以避免质粒断裂或基因组 DNA 断裂。

• 若产量偏低，可提高农杆菌菌液体积。

注意事项二

1，点板之前，阴性对照，阳性对照，试验组的OD值要调一致；起始OD600值一般为0.5，根据实验结果也可以调整为0.05-1.0之间，但阴性对照，阳性对照，试验组的OD值一定要调一样。

2，稀释倍数可根据实验调整，可按10倍稀释也可按5倍稀释，设置3-5个梯度均可。