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大肠杆菌转化

在构建或扩繁病毒质粒时,平板长出偏小或偏大的克隆,应该选择哪种克隆进行后续实验?

在构建或扩繁病毒质粒时,平板长出偏小或偏大的克隆,应该选择哪种克隆进行后续实验?

在使用Stbl3或TOP10感受态细胞构建或扩繁病毒质粒时,经常会看到在平板上长出偏小或偏大的克隆,我应该选择哪种克隆进行后续实验? 答:我们推荐挑选直径偏小的克隆进行后续实验,Stbl3和TOP10菌株在构建或扩繁病毒质粒过程中都有可能产生末端重复区的错误重组(Stbl3菌株错误重组率约为30%;TOP10菌株错误...

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可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable扩繁病毒质粒吗?

可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable扩繁病毒质粒吗?

可以用TOP10或DH5α代替Stbl3或Stable扩繁病毒质粒吗? 答:可以代替,Stbl3菌株和Stable菌株在病毒构建和扩繁过程中具有很低的错误重组概率,我们推荐在试验中优先使用。普通大肠杆菌如TOP10或DH5α也可以扩繁病毒质粒,只是产量要低一些,并且在扩繁过程中容易产生错误重组,导致一些必要元件的删除...

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在使用Stbl3感受态时怎样提高病毒质粒的产量?

在使用Stbl3感受态时怎样提高病毒质粒的产量?

在使用Stbl3感受态时怎样提高病毒质粒的产量? 答:Stbl3菌株基因组中核酸内切酶A1基因(endA1+)为野生型,没有被突变。在质粒提取过程中,微量的endA1与质粒一起被提取,导致质粒降解。为了提高Stbl3菌株中的病毒质粒产量,可采用以下方法: A,使用商业化的高纯度质粒提取试剂盒(推荐:QIAGEN #1...

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同一批感受态细胞,阳性对照能长出密密麻麻的菌落,而连接产物转化却一个菌都没长出来?

同一批感受态细胞,阳性对照能长出密密麻麻的菌落,而连接产物转化却一个菌都没长出来?

同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些? 答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完...

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感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗? 答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。

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涂布Amp板后,有很多卫星菌落,单菌落长不大

涂布Amp板后,有很多卫星菌落,单菌落长不大

涂布Amp+板后,总是有很多卫星菌落,单菌落长不大。 答:Amp抗性板铺板密度过高或培养时间过长都会导致出现对Amp敏感的卫星菌量,因此涂布Amp抗性板时菌密度应适当降低,同时37℃培养时间不超过20h。另外推荐选择培养基中使用羧苄青霉素代替氨苄青霉素(Amp),并将抗生素浓度提高到100µg/ml,可使情况改善。

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转化后大量长菌,呈长融的态势

转化后大量长菌,呈长融的态势

连接产物转化后大量长菌,完全是一种长融的态势,在转化前感受态DH5α在Amp+,Kan+中都未能摇起来,说明感受态没有被污染,这是为什么? 答:每次实验中都应设有阳性对照以估计转化效率,设立阴性对照已消除可能的污染及查明失败的原因。出现上述情况,可能是菌量过多或者感受态细胞在操作过程中污染。请先确定不加DNA只有感受...

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单菌落长不起来!

单菌落长不起来!

以1µg/µl 的pUC19为标准质粒转化感受态细胞,涂布Amp+板后,总是大片大片的,单菌落长不起来!已检测过抗生素没问题。整个过程在超净工作台操作,并且十分注意无菌操作,以及做实验所需的各种器皿,离心管等的清洁,专用!不知是什么原因? 答:在排除抗生素是否失效的原因后,请检查转化步骤!在完整质粒重转操作时,请勿将...

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