今天是2020年9月20日 星期日,欢迎光临本站 上海唯地生物技术有限公司 网址: www.weidibio.com

酵母感受态细胞

Y1HGold

文字:[大][中][小] 2015-8-27    浏览次数:6356    
            Y1HGold Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: YC1001)

Y1HGold Competent Cell:                                  100μl/支              保存: -80℃(3个月)

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12个月)

Carrier DNA (10 μg/μl)                                            100μl              保存:-20℃(12个月)

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12个月)



基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1


产品说明

Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株,MATα型,可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为:ura3leu2;报告基因为:AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用:pAbAi 和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA,用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi中);质粒pGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理:Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素,在低浓度 (0.1-0.2 µg/ml)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株 (Bait-Reporter Yeast Strains),当猎物蛋白 (Prey)结合到诱饵序列 (Bait DNA)上,GAL4 AD就会激活AbAr的表达,从而能够在含有抗生素AbA 的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点,可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。


操作方法

1. pBait-AbAi质粒5µgBstBI BbsI酶切1小时,回收。

2. 100 μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞,依次加入预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg(体积不高于15 µl),Carrier DNA (95-1005 min,快速冰浴,重复一次) 10 µlPEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)

3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。

4. ddH2O 50 µl重悬,涂SD/-Ura平板,29℃培养72 h

5. 挑取5-10个克隆,用PCR方法确定pBait-AbAi 整合到Y1HGold 基因组中,PCR 阳性菌株在SD/-Ura平板划线,29℃培养72 h4℃保存,此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。

 

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y1HGold酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培养可见直径1 mm克隆。


说明书下载

Y1HGold Chemically Competent Cell 产品说明书
返回上一步
打印此页
[向上]
在线客服

销售QQ

技术QQ

咨询电话:
021-34790199

请扫描二维码
打开手机站