今天是2020年9月20日 星期日,欢迎光临本站 上海唯地生物技术有限公司 网址: www.weidibio.com

酵母感受态细胞

NMY51

文字:[大][中][小] 2015-8-27    浏览次数:6124    

                NMY51 Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: YC1040)

NMY51 Competent Cell:                                     100μl/支              保存: -80℃(3个月)

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12个月)

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存:-20℃(12个月)

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12个月)


基因型
MATahis3Δ200trp1-901, leu2-3112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4

产品说明

DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation marker为:trp1leu2-3,报告基因为:HIS3ADE2lacZ,第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选,三个独立的报告基因,受不同启动子的调控,降低假阳性几率。原理:泛素 (ubiquitin)分子量很小,由 76 aa残基组成;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的 N端,然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分:N端 (Nub),C端 (Cub)。首先,人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低,避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次,将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。最后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用,就会促使 NubG和 Cub的相互接近,被 UBPs识别,导致 LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,筛选标志均为LEU;三种Prey质粒:pPR3-C ,pPR3-SUC,pPR3-STE,筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。


操作方法

1. 100 µl冰上融化的NMY51感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µgCarrier DNA (95-1005min,快速冰浴,重复一次)10 µlPEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)

3. 5000 rpm离心 40s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。

4. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. NMY51酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培养可见直径1 mm克隆。


说明书下载

NMY51 Chemically Competent Cell 产品说明书


返回上一步
打印此页
[向上]
在线客服

销售QQ

技术QQ

咨询电话:
021-34790199

请扫描二维码
打开手机站