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克隆感受态_热激

Stbl4

文字:[大][中][小] 2019-3-1    浏览次数:1103    

Stbl4 Chemically Competent Cell 产品说明书 




产品规格(CAT#: DL1047)

Stbl4:                                                              100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                         10μl

保存条件(保质期):                                  -80℃(6个月) 


基因型

F′ proAB+ lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)mcrA ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1∆(lac-proAB)


产品说明

Stbl4菌株来源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒载体或逆转录病毒载体的构建。Stbl4菌株适合克隆不稳定插入片段 (正向重复序列,逆转录病毒序列等);mcrA突变和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使该菌株更适于克隆甲基化的基因组序列。recA 1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacIqZΔM15标记使得Stbl4菌株可用于蓝、白斑筛选。此菌株具有四环素抗性。唯地生物生产的Stbl4感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达1×108 cfu/μg DNA。


操作方法

1. Stbl4感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (LB),混匀后37℃,200 rpm复苏70分钟。

当质粒中含有不稳定片段时,30℃培养可降低错误重组的概率,若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃,225 rpm复苏60分钟

4. 5000 rpm离心1分钟收集菌体,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上,平板倒置放于37℃培养箱过夜培养17-20小时或30℃培养箱过夜培养20-24小时。若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃培养过夜

5.若要获得大量,高纯度质粒,建议在TB培养基中30度摇菌培养(以标准质粒PUC19为例:500ml三角瓶中加入100ml TB营养液,经30度250rpm摇菌,可提取约100-200ug PUC19质粒)


●TB 培养基配方
1.2%     Tryptone
2.4% Yeast Extract
4%        甘油
17mM   KH2PO4
72mM   K2HPO4
配制方法(1L):
1,   配制磷酸缓冲液(0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4):
溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去离子水中,定容到100ml,高压灭菌。
2,在烧杯中加入以下试剂:Tryptone 12g, Yeast Extract    24g,甘油  4ml;加入去离子水800ml,充分溶解后,定容至900ml,高压灭菌。
3,待溶液冷却至60度以下,加入100ml 灭菌磷酸盐缓冲液。


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存

放会降低转化效率。

2. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。





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Stbl4 Chemically Competent Cell 产品说明书


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