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克隆感受态_电转

Stbl4 Electro

文字:[大][中][小] 2019-2-26    浏览次数:1002    

Stbl4 Electroporation-Competent Cell 产品说明书




产品规格(CAT#: DE1047)

Stbl4 Electroporation-Competent Cell                   50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存条件(保质期):                                         -80℃(6个月)


基因型

FproAB+ lacIqZM15 Tn10 (TetR)mcrA (mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1(lac-proAB)


产品说明

Stbl4菌株来源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒载体或逆转录病毒载体的构建。Stbl4菌株适合克隆不稳定插入片段 (正向重复序列,逆转录病毒序列等);mcrA突变和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使该菌株更适于克隆甲基化的基因组序列。recA 1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacIqZΔM15标记使得Stbl4菌株可用于蓝、白斑筛选,此菌株具有四环素抗性。唯地生物生产的Stbl4电击感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达0.5×1010 cfu/μg DNA,特别适合于慢病毒质粒文库或逆转录质粒文库的构建。


操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的Stbl4电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

       A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;

       B. 对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与Stbl4电击感受态混合后电击转化,无需            进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。

       C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                  EDTA)重悬,然后与Stbl4电击感受态混合进行电击转化。

3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。

4. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。30℃,225 rpm复苏90分钟。当质粒中含有不稳定片段时,30℃培养可降低错误重组的概率,若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃,225 rpm复苏60分钟

6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养17-20小时或30℃培养箱过夜培养20-24小时。若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃培养过夜

7.若要获得大量,高纯度质粒,建议在TB培养基中30度摇菌培养(以标准质粒PUC19为例:500ml三角瓶中加入100ml TB营养液,经30度250rpm摇菌,可提取约100-200ug PUC19质粒)


S.O.C 培养基配方       

     2% Tryptone                          

1.2%     Tryptone

2.4% Yeast Extract

4%        甘油

17mM   KH2PO4

72mM   K2HPO4

    

TB培养基配方               

1.2%     Tryptone                                          

2.4% Yeast Extract                                             

4%        甘油                                                   

17mM   KH2PO4                                          

72mM   K2HPO4                                            


配制方法(1L):1,配制磷酸缓冲液(0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4):

溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去离子水中,定容到100ml,高压灭菌。2,在烧杯中加入以下试剂:Tryptone  12g, Yeast Extract  24g,甘油  4ml;加入去离子水800ml,充分溶解后,定容至900ml,高压灭菌。待溶液冷却至60度以下,加入100ml 灭菌磷酸盐缓冲液。


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


注意事项

1. Stbl4电击感受只能电击转化,不可用热激方法转化。加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

6. 对于连接产物转化,部分公司的连接体系或重组体系(例如:Thermo,NEB公司的T4 连接酶系统,NEB,天根的50度反应重组系统)可以直接与Stbl4电击感受态混合后电击转化,无需纯化,但DNA浓度不能过高,最好不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。

7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。




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