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R5421

文字:[大][中][小] 2018-1-2    浏览次数:833    

R5421 Chemically Competent Cell 产品说明书



 

产品规格 (CAT#: YC1080)

R5421 Competent Cell:                                       100μl/支              保存: -80℃(3个月)

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12个月)

Carrier DNA (5 μg/μl)                                              100μl              保存:-20℃(12个月)

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12个月)


基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64


产品说明

R5421酿酒酵母菌株为K+/钾离子缺陷型菌株,在文献中也称为CY162,MATα型,多用于K+/钾离子转运蛋白的鉴定试验中,也可用于K+/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定试验。Transformation marker为:ura3leu2,该菌株可以在含有100mM KCl的培养基中国正常生长,在含有5-10mM KCl的培养基中生长缓慢,当培养基中KCl浓度低于0.5mM,R5421(CY162)细胞停止生长。R5421感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>103 cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态,步骤如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min,快速插入冰中,静置3 min,再次放95℃水浴或金属浴3 min,快速插入冰中,静置3 min以上。

2. 取100 µl冰上融化的R5421感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒0.5-3 µg,Carrier DNA10 µl,PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀,30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。

5. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。



注意事项


1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. R5421酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1 mm克隆。



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