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农杆菌感受态_化转

GV3101 (pJIC SA_Rep)

文字:[大][中][小] 2018-7-20    浏览次数:1370    

GV3101 (pJIC SA_Rep) Chemically Competent Cell 产品说明书





产品规格 (CAT#: AC1004)

GV3101 (pJIC SA_Rep):                                           100μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl )                                    10μl
保存条件(保质期):                                         -80℃(12个月) 


基因型


C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pJIC SA_Rep -tetR)



产品说明

GV3101(pJIC SA_Rep)菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签:gent,赋予GV3101菌株庆大霉素抗性;在GV3101菌株中转入help质粒:pJIC SA_Rep即为GV3101(pJIC SA_Rep)菌株,可帮助pgR106,pgR107,pGreen,pGs2系列质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tet)抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产的GV3101(pJIC SA_Rep)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>103 cfu/μg DNA。



操作方法

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素(不含四环素抗性)的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天

(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。


 

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量,本公司生产的GV3101(pJIC SA_Rep)化学转化感受态细胞具有四环素抗性,但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时,只需加入目标质粒抗性的抗生素,不加四环素。

3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。



备注

1、农杆菌相关抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧苄青霉素(carb

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

链霉素(strep

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

庆大霉素(gent

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S


3LBYEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

PH7.0

PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g

 

 

 

NaOH 

PH7.0

PH7.0

 

 

 

Agar

15 g

 




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