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发根农杆菌_电转

ATCC15834 Electro

文字:[大][中][小] 2018-7-5    浏览次数:2315    
        ATCC15834 Electroporation-Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: AE1100)
ATCC15834 Electro:                                                   50μl/支
pCAMBIA2301(control vector,10ng/μl ):                 10μl

保存条件(保质期):                                          -80℃(12个月)


基因型


Agrobacterium rhizogenes pRi15834 (agropine type)


产品说明

发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌,它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC(美国模式培养物集存库/American type culture collection),为发根农杆菌原始菌株( wild strain),含有pRi15834农杆碱型Ri质粒,具有广泛的宿主范围(禾本科,豆科,烟草等),特别适合对紫杉醇,青蒿等药用植物毛状根的诱导。唯地生物开发的ATCC15834电转感受态细胞经特殊工艺制作,pCAMBIA2301质粒(卡那霉素抗性)检测,转化效率>105 cfu/μg DNA。


常规操作方法

1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1 μg质粒DNA(体积不大于6ul,最好用试剂盒抽提,双蒸水溶解;转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。

3. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数为Biorad 推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯从冰中拿出,吸水纸吸干外表面水份,快速放入电转槽中,启动电击,电击完成快速插入冰中,加入1 ml无抗生素的TY,并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的平板上,倒置放于28℃培养箱培养72小时


ATCC15834菌株质粒转化相关抗生素使用浓度:

抗生素

配方

筛选培养基

原液

工作液

硫酸卡那霉素 (kan)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

YMBTY

100 mg/ml

100 μg/ml

壮观霉素 (spec)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

TY

50 mg/ml

70 μg/ml


常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

氯霉素(cam)

硫酸卡那霉素(kan)

Ar.A4

S

S

S

S

R

ATCC15834

S

S

S

S

S

MSU440

S

R

S

S

S

Ar.Qual

S

R

S

R

S


● YMB配方(1L):

       Yeast extract            1g

       MgSO4·7H2O        0.2g

       K2HPO4                0.5g

       NaCl                     0.1g

       甘露醇                    10g

       补水到1L体积,完全溶解后,调PH值到7.0,121度、20分钟高温灭菌

       若配制YMB固体培养基,则加入15g 琼脂粉。




● TY配方(1L):

       Tryptone                5g

       Yeast extract          3g

       补水到1L体积,完全溶解后,121度、20分钟高温灭菌

       配制1M的氯化钙水溶液,121度、20分钟高温灭菌

       每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。

       若配制TY固体培养基,则加入15g 琼脂粉。



注意事项

1. ATCC15834生长缓慢,转化质粒的ATCC15834菌涂布在含抗生素的平板上应生长72小时。

2. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

3. 电转感受态细胞中不可混入气泡,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。




说明书下载

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